Le curve di calibrazione sono usate per capire la risposta strumentale a un analita e per prevedere la concentrazione dell’analita in un campione.
Una curva di calibrazione viene creata preparando prima una serie di soluzioni standard con concentrazioni note dell’analita. La risposta dello strumento viene misurata per ciascuna di esse e tracciata rispetto alla concentrazione della soluzione standard. La parte lineare di questo grafico può quindi essere utilizzata per prevedere la concentrazione di un campione dell’analita, correlando la sua risposta alla concentrazione.
Questo video introdurrà le curve di calibrazione e il loro utilizzo, dimostrando la preparazione di un set di standard, seguita dall’analisi di un campione con concentrazione sconosciuta.
Per preparare la curva di calibrazione viene utilizzato un set di soluzioni standard. Queste soluzioni consistono in una gamma di concentrazioni che comprendono la concentrazione approssimativa dell’analita.
Le soluzioni standard sono spesso preparate con una diluizione seriale. Una diluizione seriale viene eseguita preparando prima una soluzione stock dell’analita. La soluzione stock viene poi diluita di una quantità nota, spesso un ordine di grandezza. La nuova soluzione viene poi diluita nello stesso modo, e così via. Questo si traduce in una serie di soluzioni con concentrazioni che vanno su diversi ordini di grandezza.
La curva di calibrazione è un grafico del segnale strumentale rispetto alla concentrazione. La trama degli standard dovrebbe essere lineare e può essere adattata con l’equazione y=mx+b. Le porzioni non lineari del grafico dovrebbero essere scartate, poiché questi intervalli di concentrazione sono fuori dal limite di linearità.
L’equazione della linea più adatta può essere utilizzata per determinare la concentrazione del campione, utilizzando il segnale dello strumento per correlare la concentrazione. I campioni con misurazioni che si trovano al di fuori dell’intervallo lineare del grafico devono essere diluiti, per rientrare nell’intervallo lineare.
Il limite di rilevazione dello strumento, o la misurazione più bassa che può essere determinata statisticamente sopra il rumore, può essere calcolato anche dalla curva di calibrazione. Un campione bianco viene misurato più volte. Il limite di rilevazione è generalmente definito come il segnale medio del bianco più 3 volte la sua deviazione standard.
Infine, anche il limite di quantificazione può essere calcolato. Il limite di quantificazione è la quantità più bassa di analita che può essere quantificata con precisione. Questo è calcolato come 10 deviazioni standard sopra il segnale del bianco.
Ora che hai imparato le basi di una curva di calibrazione, vediamo come prepararla e usarla in laboratorio.
Prima di tutto, prepara una soluzione concentrata dello standard. Pesare accuratamente lo standard e trasferirlo in un matraccio volumetrico. Aggiungere una piccola quantità di solvente e mescolare in modo che il campione si dissolva. Poi, riempire fino alla linea con il solvente. È importante usare lo stesso solvente del campione.
Per preparare gli standard, pipettare la quantità necessaria nel matraccio volumetrico. Poi riempire il matraccio fino alla linea con il solvente e mescolare.
Continuare a preparare gli standard pipettando dalla soluzione stock e diluendo. Per una buona curva di calibrazione, sono necessarie almeno 5 concentrazioni.
Ora, eseguire i campioni con lo strumento analitico, in questo caso uno spettrofotometro UV-Vis, al fine di determinare la risposta strumentale necessaria per la curva di calibrazione.
Prendere la misura del primo standard. Esegui gli standard in ordine casuale, nel caso in cui ci siano errori sistematici. Misurare ogni standard 3-5 volte per ottenere una stima del rumore.
Misurare il resto degli standard, ripetendo le misure per ciascuno. Registra tutti i dati.
Finalmente, esegui il campione. Usare la stessa matrice del campione e le stesse condizioni di misurazione usate per gli standard. Assicurati che il campione sia all’interno dell’intervallo degli standard e del limite dello strumento.
Per costruire la curva di calibrazione, usa un programma per computer per tracciare i dati come segnale vs. concentrazione. Usa la deviazione standard delle misurazioni ripetute per ogni punto di dati per fare le barre di errore.
Rimuovi le porzioni della curva che non sono lineari, poi esegui una regressione lineare e determina la linea più adatta. Il risultato dovrebbe essere un’equazione nella forma y = m x + b. Un valore R2 vicino a 1 denota un buon adattamento.
Questa è la curva di calibrazione per il colorante blu #1, misurata a 631 nm. La risposta è lineare tra 0 e 15 mM.
Calcolare la concentrazione del campione usando l’equazione della linea più adatta. L’assorbanza per il campione era 0,141, e corrispondeva a una concentrazione di 6,02 mM.
Ora che hai visto come una curva di calibrazione può essere usata con uno spettrofotometro UV-Vis, diamo un’occhiata ad alcune altre applicazioni utili.
Le curve di calibrazione sono spesso usate con applicazioni elettrochimiche, poiché il segnale dell’elettrodo deve essere calibrato alla concentrazione di ioni nella soluzione. In questo esempio, i dati sono stati raccolti per un elettrodo ionoselettivo per il fluoruro.
I dati di concentrazione devono essere tracciati sulla scala log per ottenere una linea. Questa curva di calibrazione può essere usata per misurare la concentrazione di fluoruro in una soluzione, come il dentifricio o l’acqua potabile.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è una tecnica di separazione e analisi molto usata nella chimica analitica. L’HPLC separa i componenti di una miscela in base al tempo necessario alle molecole per percorrere la lunghezza della colonna cromatografica. Questo tempo varia a seconda di una serie di proprietà chimiche delle molecole.
L’eluizione delle molecole viene misurata utilizzando un rivelatore, ottenendo un cromatogramma. L’area del picco può essere correlata alla concentrazione utilizzando una semplice curva di calibrazione di una gamma di soluzioni standard, come in questo esempio di ingredienti popolari di soda.
In alcuni casi, dove la matrice della soluzione interferisce con la misurazione del soluto, una curva di calibrazione classica può essere imprecisa. In questi casi, viene preparata una curva di calibrazione modificata. Per questo, una gamma di volumi di soluzione standard viene aggiunta al campione. Viene creato il grafico del segnale alla concentrazione, dove l’intercetta x è uguale alla concentrazione originale della soluzione campione. Per maggiori dettagli su questa tecnica, guarda il video di educazione scientifica di JoVE, “Il metodo dell’aggiunta dello standard”.
Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla curva di calibrazione. Ora dovresti aver capito dove si usa la curva di calibrazione, come crearla, e come usarla per calcolare le concentrazioni dei campioni.
Come sempre, grazie per aver guardato!