La espectrometría de masas (EM) es un tipo de análisis utilizado para determinar qué moléculas componen una muestra, basándose en el espectro de masas que crean los iones. Los espectrómetros de masas son capaces de realizar la identificación y cuantificación tradicional de analitos objetivo; sin embargo, también pueden utilizarse en un entorno clínico para la identificación rápida de bacterias. El agente causante de la sepsis cambia con el tiempo, y las decisiones clínicas que afectan al tratamiento de las infecciones suelen basarse en los resultados de la identificación bacteriana. Por lo tanto, es esencial que dichas identificaciones se realicen rápidamente y se interpreten correctamente. El espectrómetro de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es uno de los instrumentos de EM más populares utilizados en biología, debido a su rápida y precisa identificación de géneros y especies de una amplia gama de bacterias Gram-negativas y positivas. La identificación de microorganismos por espectrometría de masas se basa en la identificación de un espectro característico de cada especie y su posterior cotejo con una amplia base de datos dentro del instrumento. La presente revisión ofrece una perspectiva contemporánea sobre los retos y las oportunidades de la identificación bacteriana, así como un informe escrito sobre cómo la innovación tecnológica ha hecho avanzar la EM. También se abordarán las futuras aplicaciones clínicas, en particular el uso de la EM MALDI-TOF en el campo de la microbiología para la identificación y el análisis de la resistencia a los antibióticos.