Historia
La clonación de bovinos comenzó en nuestro laboratorio en 1986 con la introducción de células donantes nucleares en fase de clivaje embrionario en ovocitos enucleados en metafase II, dando como resultado la preñez y el nacimiento de dos terneros sanos (Prather et al., 1987). Nuestro éxito y el de Granada Genetics casi al mismo tiempo fueron posibles gracias a varios factores. Los estudios en anfibios demostraron que el desarrollo más avanzado se produce a partir de la transferencia de núcleos en ovocitos metafásicos enucleados en lugar de cigotos pronucleados enucleados (Hoffner y DiBerardino, 1980). Los estudios realizados en ratones demostraron que la frecuencia de desarrollo tras la transferencia nuclear (TN) era mucho mayor cuando los núcleos se fusionaban en ovocitos de ratón en lugar de ser microinyectados (McGrath y Solter, 1983). Los estudios de Willadsen (1986) en ovejas demostraron que se podían producir corderos mediante la electrofusión de células madre embrionarias en ovocitos enucleados en metafase II. La aparición de métodos para la producción de embriones in vitro y para el cultivo de embriones hasta la fase de blastocisto también facilitó el advenimiento de la clonación de ganado, ya que los embriones bovinos se transferían comúnmente a las vacas en la fase de blastocisto para producir crías (First, 1990; Gordon, 1994; Fulka et al, 1998).
Las células madre embrionarias derivadas de la fase de clivaje hasta la fase de mórula se utilizaron para transferirlas a ovocitos enucleados en metafase en estos primeros estudios porque la literatura temprana sobre anfibios sugería que las células madre embrionarias eran totipotentes pero que las células somáticas o fetales diferenciadas no lo eran (DiBerardino, 1988; DiBerardino, 1997). Esto fue confirmado en mamíferos por estudios como el de Navara et al. (1994). En este estudio, las células polarizadas y comprometidas con el linaje del trofoblasto se utilizaron como donantes nucleares y dieron lugar a muy pocos embriones en fase de blastocisto (7%; n=158), mientras que las células no polarizadas y no diferenciadas utilizadas como donantes nucleares produjeron una alta frecuencia de blastocistos (47%; n=184). En comparación, el 30% de 139 embriones no seleccionados se desarrollaron hasta el estadio de blastocisto. La conclusión de los años ochenta de que sólo los tipos celulares no diferenciados eran eficaces desde el punto de vista del desarrollo como donantes nucleares se debió a la importante limitación técnica de que los métodos artificiales eran incapaces de activar los ovocitos tan rápida y eficazmente como los espermatozoides (Ware et al., 1989). Esto obligó a utilizar ovocitos envejecidos, que habían perdido la capacidad de reprogramar un núcleo diferenciado. En la tabla 20.1 del primer laboratorio se muestra una comparación de ovocitos jóvenes y envejecidos. De hecho, en muchos de los primeros protocolos el mejor éxito se conseguía cuando el ovocito estaba tan envejecido que la envoltura nuclear de la célula donante y su contenido se conservaban intactos sin que se rompiera la envoltura nuclear (Saeki et al., 1991; Leibfried-Rutledge et al., 1992; Poccia y Collas, 1997). Los ovocitos que estaban moderadamente envejecidos permitirían la ruptura de la envoltura nuclear, pero volverían a ensamblar rápidamente la envoltura nuclear y excluirían parte de la cromatina del núcleo.
Tabla 20.1. Uso de ovocitos jóvenes frente a envejecidos en la transferencia nuclear
| Proceso | 24 Horas | 48 Horas |
|---|---|---|
| Activación artificial activación | Mala | Excelente |
| Descomposición y remontaje de la envoltura nuclear | Sí | No |
| Sincronía de núcleo y ovocito | Esencial | No esencial |
| Reprogramación celular y genómica reprogramación de la célula donante | Sí | No |
| Secuencia y momento de la activación | Crítico | No crítico | Células donantes exitosas | Diferenciadas adultas o fetales | Tototípicas embrionarias |
La activación también puede lograrse mediante la inhibición de la síntesis de proteínas con cicloheximida (CHX) después de un tratamiento con ionóforos, seguido de la incubación con citocalasina B (CB) para evitar la extrusión de cromatina de la célula y mantener así un estado diploide (Liu y Yang, 1999). Bhak et al. (2006) estudiaron la tasa de desarrollo y la ploidía de los embriones producidos por la TN con diferentes tratamientos de activación en el ganado. En este estudio, se compararon tres métodos de activación de ovocitos, a saber, ionomicina sola, ionomicina+DMAP, e ionomicina y CHX, para el desarrollo de embriones producidos por TNC a partenotas y homólogos de FIV. Los resultados sugieren que el tratamiento con DMAP después de la ionomicina aumenta en gran medida las tasas de desarrollo de los partenotes, pero no difiere en el desarrollo de los blastocistos en comparación con el tratamiento con CHX. Sin embargo, el tratamiento con DMAP aumentó la tasa de escisión en función del tiempo hasta llegar a los embriones en fase de dos células. Además, aumentó en gran medida la incidencia de anomalías cromosómicas en partenotes y embriones SCNT. Bhak et al. (2006) concluyeron que la CHX combinada con la ionomicina es más conveniente que la DMAP para la activación de ovocitos durante la TN en el ganado. La dehidroleucodina (DhL) se evaluó como activador químico de ovocitos bovinos y embriones reconstituidos por SCNT (Bhak et al., 2006). Más recientemente, DhL fue evaluado como activador químico de ovocitos bovinos y embriones reconstituidos por SCNT (Canel et al., 2010). Los ovocitos se activaron con dosis bajas y altas de ionomicina y se expusieron a dosis bajas y altas de DhL solas o, alternativamente, combinadas con CB. Los resultados mostraron que DhL induce una dinámica de formación pronuclear más similar a la de los embriones producidos por FIV que el DMAP y que los niveles bajos de DhL facilitan el desarrollo de blastocistos. Estos resultados indican que un bajo nivel de DhL1 combinado con una larga exposición al protocolo CB podría ser útil para los programas SCNT (Canel et al., 2010).
El desarrollo de blastocistos tras la fecundación in vitro o TN se vio reforzado por el descubrimiento de que los primeros ovocitos que alcanzaban la metafase II aproximadamente a las 16 h de la extracción del folículo, al ser inseminados 8 h después, producían una frecuencia de blastocistos mucho mayor que la de los embriones obtenidos a partir de ovocitos maduros a las 24 h (Dominko y First, 1997). La capacidad de producir ovocitos jóvenes altamente competentes que pudieran ser activados tempranamente nos permitió producir blastocistos, embarazos y crías a partir de la masa celular interna de los blastocistos que habían sido cultivados, multiplicados y pasados durante cuatro a seis pasajes (First et al., 1994; Sims y First, 1994). La eficiencia no fue alta; aproximadamente el 15% de las TN produjeron blastocistos y cuatro terneros resultaron de 34 transferencias de embriones. La tipificación del ADN de estas crías confirmó que su identidad coincidía con las líneas celulares de las que se derivaron (First et al., 1994). La eficacia de la TN fue mayor cuando se utilizaron blastómeros en fase de clivaje o células de mórula en el modelo de ovocitos envejecidos. Más recientemente, Kwun et al. (2003) demostraron que el cultivo de embriones producidos in vitro o mediante TN se desarrollaban hasta el estadio de blastocisto normal a una velocidad mayor en presencia de una combinación de fructosa y glucosa. Este grupo llegó a la conclusión de que la fructosa podría ser un sustrato energético más eficiente que la glucosa para producir un gran número de blastocistos transferibles derivados de la TNCS (Kwun et al., 2003). Una alternativa a la fusión del núcleo de una célula en un ovocito enucleado, en lugar de por microagujas o electrofusión, es el uso de virus fusogénicos inactivados para insertar el núcleo de la célula en el ovocito enucleado, tal y como presentaron y revisaron Rodríguez et al. (2008). Con este método, a la mitad de un ovocito enucleado se le coloca un núcleo donante con otro medio ovocito fusionado encima. Esto dio lugar a que el 65,7% de los ovocitos se convirtieran en blastocistos cuando el núcleo procedía de una célula somática adulta y el 38,2% cuando el núcleo donante procedía de una célula fetal (Rodríguez et al, 2008).
Usando células embrionarias como donantes, entre el 20 y el 50% de las transferencias nucleares han dado lugar a blastocistos para ser transferidos a vacas, de los cuales aproximadamente el 50% se convierten en gestaciones.
En 1993, se habían producido cientos de terneros a partir de TN usando células embrionarias como donantes nucleares. Hasta la fecha, este número ha crecido, pero no de forma exponencial como cabría esperar. El éxito de la TN requiere el borrado completo de la impronta genómica y del estado de metilación y la reprogramación perfecta del genoma de la célula donante. El genoma reprogramado debe mantener su estabilidad a lo largo del desarrollo y finalmente dar lugar a una descendencia viable con órganos normalmente diferenciados. Se ha logrado la reclonación y se han utilizado células donantes congeladas, órganos congelados sin crioprotector, así como ovocitos madurados in vitro (Stice y Keefer, 1993; Barnes et al., 1993). En el mejor de los casos, el 20-50% de las TN han dado lugar a blastocistos para su transferencia a las vacas, de los cuales aproximadamente el 50% se convierten en preñeces. Sin embargo, las pérdidas de preñez son mayores de lo normal, ya que hasta un 20% no logra dar a luz y requiere la inducción del parto, resultando a menudo terneros más grandes de lo normal (Rodríguez-Osorio et al., 2009, 2012; Oback y Wells, 2007; Cibelli, 2007; Niemann et al., 2008; Kato et al., 1998; Oback 2009).
Las empresas comerciales han intentado mejorar la eficiencia de la clonación embrionaria hasta un nivel y coste adecuados para la producción comercial de ganado. Lamentablemente, no se ha alcanzado un nivel de eficiencia suficiente. En el caso del ganado lechero, la producción de clones embrionarios de ganado de alta producción de leche requería la cría hasta la producción de leche y luego la selección de líneas clonales embrionarias de alta producción de leche. El interés comercial por la clonación embrionaria desapareció con la llegada de la clonación a partir de células germinales primordiales y de líneas de células somáticas fetales o adultas. Todavía hay intentos de cultivar células madre embrionarias bovinas hasta un número suficientemente grande para la transferencia de genes y la selección de colonias transgénicas antes de la TN (Mitalipova et al., 2001; Merton et al., 2003; Rodríguez-Martínez 2012). Más recientemente, las células madre pluripotentes inducidas se han utilizado en animales bovinos modificados genéticamente y en aplicaciones de cría transgénica (Cao et al., 2012; Han et al., 2011; Dong et al., 2007).