Las curvas de calibración se utilizan para comprender la respuesta instrumental a un analito y para predecir la concentración de analito en una muestra.
Una curva de calibración se crea preparando primero un conjunto de soluciones estándar con concentraciones conocidas del analito. La respuesta del instrumento se mide para cada una de ellas y se traza en función de la concentración de la solución estándar. La parte lineal de este gráfico puede utilizarse para predecir la concentración de una muestra del analito, correlacionando su respuesta con la concentración.
Este vídeo introducirá las curvas de calibración y su uso, demostrando la preparación de un conjunto de estándares, seguido del análisis de una muestra con concentración desconocida.
Se utiliza un conjunto de soluciones estándar para preparar la curva de calibración. Estas soluciones consisten en un rango de concentraciones que abarcan la concentración aproximada del analito.
Las soluciones estándar suelen prepararse con una dilución en serie. Una dilución en serie se realiza preparando primero una solución madre del analito. A continuación, la solución madre se diluye en una cantidad conocida, a menudo un orden de magnitud. La nueva solución se diluye de la misma manera, y así sucesivamente. Esto da como resultado un conjunto de soluciones con concentraciones que varían en varios órdenes de magnitud.
La curva de calibración es un gráfico de la señal instrumental frente a la concentración. El gráfico de los estándares debe ser lineal, y puede ajustarse con la ecuación y=mx+b. Las partes no lineales del gráfico deben descartarse, ya que estos rangos de concentración están fuera del límite de linealidad.
La ecuación de la línea de mejor ajuste puede utilizarse entonces para determinar la concentración de la muestra, utilizando la señal del instrumento para correlacionarla con la concentración. Las muestras con mediciones que se encuentran fuera del rango lineal del gráfico deben diluirse, para estar en el rango lineal.
El límite de detección del instrumento, o la medición más baja que puede determinarse estadísticamente por encima del ruido, puede calcularse también a partir de la curva de calibración. Una muestra en blanco se mide varias veces. El límite de detección se define generalmente como la señal media del blanco más 3 veces su desviación estándar.
Por último, también puede calcularse el límite de cuantificación. El límite de cuantificación es la menor cantidad de analito que puede cuantificarse con precisión. Se calcula como 10 desviaciones estándar por encima de la señal en blanco.
Ahora que ha aprendido los fundamentos de una curva de calibración, veamos cómo preparar y utilizar una en el laboratorio.
Primero, prepare una solución madre concentrada del estándar. Pese con precisión el estándar y transfiéralo a un matraz volumétrico. Añada una pequeña cantidad de disolvente y mezcle para que la muestra se disuelva. A continuación, llene hasta la línea con disolvente. Es importante utilizar el mismo disolvente que la muestra.
Para preparar los estándares, pipetee la cantidad necesaria en el matraz aforado. A continuación, llene el matraz hasta la línea con disolvente y mezcle.
Continúe haciendo los estándares pipeteando desde la solución madre y diluyendo. Para obtener una buena curva de calibración, se necesitan al menos 5 concentraciones.
Ahora, ejecute las muestras con el instrumento analítico, en este caso un espectrofotómetro UV-Vis, para determinar la respuesta instrumental necesaria para la curva de calibración.
Tome la medida del primer estándar. Ejecutar los estándares en orden aleatorio, por si hubiera algún error sistemático. Mida cada estándar de 3 a 5 veces para obtener una estimación del ruido.
Mida el resto de los estándares, repitiendo las mediciones para cada uno. Registre todos los datos.
Por último, ejecute la muestra. Utilice la misma matriz de muestra y las mismas condiciones de medición que se utilizaron para los estándares. Asegúrese de que la muestra está dentro del rango de los estándares y del límite del instrumento.
Para construir la curva de calibración, utilice un programa informático para trazar los datos como señal frente a la concentración. Utilice la desviación estándar de las mediciones repetidas para cada punto de datos para hacer barras de error.
Elimine las partes de la curva que no sean lineales y, a continuación, realice una regresión lineal y determine la línea de mejor ajuste. El resultado debe ser una ecuación de la forma y = m x + b. Un valor R2 cercano a 1 denota un buen ajuste.
Esta es la curva de calibración para el colorante azul nº 1, medido a 631 nm. La respuesta es lineal entre 0 y 15 mM.
Calcule la concentración de la muestra utilizando la ecuación de la línea de mejor ajuste. La absorbancia de la muestra fue de 0,141, y correspondió a una concentración de 6,02 mM.
Ahora que ha visto cómo se puede utilizar una curva de calibración con un espectrofotómetro UV-Vis, echemos un vistazo a otras aplicaciones útiles.
Las curvas de calibración se utilizan a menudo con aplicaciones electroquímicas, ya que la señal del electrodo debe calibrarse con la concentración de iones en la solución. En este ejemplo, se recogieron datos para un electrodo selectivo de iones para el fluoruro.
Los datos de concentración deben trazarse en la escala logarítmica para obtener una línea. Esta curva de calibración puede utilizarse para medir la concentración de fluoruro en una solución, como la pasta de dientes o el agua potable.
La cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, es una técnica de separación y análisis muy utilizada en la química analítica. La HPLC separa los componentes de una mezcla en función del tiempo que necesitan las moléculas para recorrer la longitud de la columna cromatográfica. Este tiempo varía en función de una serie de propiedades químicas de las moléculas.
La elución de las moléculas se mide mediante un detector, lo que da lugar a un cromatograma. El área del pico puede correlacionarse con la concentración utilizando una curva de calibración simple de una gama de soluciones estándar, como en este ejemplo de ingredientes de refrescos populares.
En algunos casos, cuando la matriz de la solución interfiere con la medición del soluto, una curva de calibración clásica puede ser inexacta. En esos casos, se prepara una curva de calibración modificada. Para ello, se añade a la muestra un rango de volúmenes de solución estándar. Se crea un gráfico de señal a concentración, donde la intercepción x es igual a la concentración original de la solución de la muestra. Para obtener más detalles sobre esta técnica, vea el vídeo de educación científica de JoVE, «El método de adición de estándar».
Acaba de ver la introducción de JoVE a la curva de calibración. Ahora deberías entender dónde se utiliza la curva de calibración, cómo crearla y cómo utilizarla para calcular las concentraciones de las muestras.
Como siempre, ¡gracias por verlo!