Resumen
Muchos pacientes experimentan una excelente recuperación física después de la cirugía; sin embargo, hay algunos de ellos que sufren fluctuaciones del estado de ánimo, incluso depresión. La depresión postoperatoria puede ser el resultado de la disfunción cognitiva, el dolor y el compromiso del sistema inmunitario durante la cirugía. Pero existe una mayor posibilidad de que la anestesia general sea responsable del desarrollo de la depresión. En este caso, empleamos uno de los anestésicos más utilizados, el propofol, en un modelo de ratón para investigar si este compuesto anestésico intravenoso podría causar un comportamiento similar a la depresión en los ratones. Descubrimos que una dosis única de propofol causaba un rendimiento conductual anormal significativo en las pruebas de suspensión de la cola, natación forzada y campo abierto. También examinamos la sección cerebral de estos ratones y revelamos que había una reducción significativa de la expresión de la proteína CD11b, lo que demostraba una inhibición del propofol en la función microglial. Investigamos el efecto del propofol en la proteína sináptica, SYP, y encontramos que no había una influencia notable en la expresión de la proteína. Estos resultados sugieren que el tratamiento con propofol podría promover los comportamientos depresivos en los ratones a través de la influencia de la función de las células microgliales. Además, descubrimos que el nivel de la citoquina IL-6 aumentaba significativamente en el tejido cerebral, lo que podría causar posteriormente la activación del factor transcripcional STAT3. Nuestro hallazgo puede proporcionar una nueva perspectiva para comprender mejor el mecanismo de los fármacos anestésicos y descifrar el mecanismo subyacente de la depresión postoperatoria.
1. Introducción
Muchos pacientes que se someten a anestesia general o a una intervención quirúrgica experimentan alguna forma de depresión postoperatoria, especialmente durante los seis meses siguientes a un procedimiento invasivo . Como una de las complicaciones frecuentes después de la cirugía, la depresión puede conducir a una mayor morbilidad y mortalidad, especialmente para los pacientes de edad avanzada . Mientras tanto, los investigadores han descubierto que los pacientes deprimidos son más propensos a tener otras complicaciones después de la cirugía . Son menos capaces de cooperar bien con los cuidadores en sus cuidados postoperatorios, como la terapia de rehabilitación. En los pacientes que ya tienen un historial de depresión o ansiedad preexistente, el tiempo de recuperación de la depresión posquirúrgica es mucho mayor . Un estudio también sugirió que la cirugía podría exacerbar la gravedad de la depresión preexistente . Hasta ahora, se sabe poco sobre el motivo de esta relación entre la cirugía y la depresión. Algunos investigadores han pensado que la razón psicológica en sí es que muchas personas experimentan una depresión posquirúrgica porque los procedimientos quirúrgicos les obligan a enfrentarse a su propia mortalidad. Algunos estudios también hicieron hincapié en los tipos específicos de cirugía per se en la inducción de la depresión posquirúrgica, ya que la depresión parece observarse con mayor frecuencia en algunas cirugías mayores, como la cirugía cerebral, la cirugía de reemplazo de cadera y la resección del cáncer. Sin embargo, estudios recientes sugieren que la duración de la anestesia parece estar relacionada con la probabilidad y la gravedad de la depresión. El propofol es uno de los anestésicos más utilizados en el ámbito de los cuidados intensivos tras la cirugía . Se ha comprobado que el tratamiento con propofol está significativamente asociado a las disfunciones cognitivas en el postoperatorio . Hasta ahora no se ha examinado si el propofol puede afectar al estado de ánimo de los pacientes y los animales, ni cómo lo hace. Por lo tanto, empleamos un modelo de ratón con una dosis única de tratamiento con propofol y comprobamos los comportamientos de tipo depresivo en el modelo de ratón. Descubrimos que los ratones expuestos a una dosis única de tratamiento con propofol ejercían comportamientos similares a la ansiedad en una prueba de campo abierto, mostrando menos tiempo en la zona central, y comportamientos similares a la depresión en las pruebas de suspensión de la cola y natación forzada, mostrando un tiempo de inmovilidad más largo que los ratones de control sin inyección de propofol. Nuestros resultados indicaron que el propofol podría ser responsable de la fluctuación del estado de ánimo después de la cirugía y este efecto podría estar asociado a la influencia del propofol sobre las células de la microglía en el sistema nervioso central (SNC).
2. Materiales y métodos
2.1. Animales y tratamiento farmacológico
En el presente estudio, se utilizaron ratones C57BL/6 machos de 8-10 semanas de edad. Todos los ratones tenían libre acceso al agua y a la comida. Para todos los estudios de animales aquí, los ratones fueron tratados estrictamente siguiendo las directrices establecidas por el Consejo Chino de Cuidado de Animales. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Hospital Municipal de Qingdao, Shandong, China. Había dos grupos de ratones en el estudio: solución salina normal (controles; ) y propofol (75 mg/kg; ). Se administró a los ratones una dosis única de propofol por vía intraperitoneal. Se utilizó una solución comercial de inyección de propofol (Xi’an Libang Pharmaceuticals, China). La dosis de propofol utilizada aquí se adaptó del estudio anterior. Durante el tiempo de anestesia, todos los ratones fueron colocados en la almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal. Las pruebas de comportamiento se realizaron 1 semana después.
2.2. Campo abierto
Aquí se utilizó una caja de madera cuadrada para la prueba de campo abierto como se ha descrito previamente . Al principio de la prueba, cada ratón se colocó en una esquina de la caja de cara a la pared. La distancia total recorrida y el tiempo total de permanencia en los cuadrados interiores de todos los ratones fueron registrados y medidos en una sesión de 5 minutos.
2.3. Prueba de suspensión de la cola
Para la prueba de suspensión de la cola, los procedimientos se realizaron como se informó previamente . Los ratones fueron suspendidos a través de la cola con una cinta en un pequeño gancho de metal, y no pueden escapar o aferrarse a las superficies cercanas en esta posición. Se registró el tiempo total que los ratones pasaron inmóviles durante los 6 minutos que duró la prueba. La inmovilidad se define como la falta de intento de los ratones de mover sus cuerpos.
2.4. Prueba de natación forzada
Llevamos a cabo la prueba de natación forzada como se informó previamente . Los ratones se colocaron en un vaso de cristal lleno de agua a temperatura ambiente. Se evaluó el tiempo total de inmovilidad de los ratones en una sesión de prueba de 15 minutos, y se puntuó la duración de la inmovilidad en los últimos 6 minutos. Al final de cada prueba, los ratones mojados se colocaron inmediatamente en una jaula con ropa de cama normal después de calentarlos con una toalla seca.
2.5. Prueba del laberinto elevado plus
El laberinto elevado plus es un método sencillo para evaluar las respuestas de ansiedad de los animales. Probamos el nivel de ansiedad de los ratones utilizando el ensayo del laberinto elevado más el laberinto como se informó previamente . Básicamente, el aparato del laberinto elevado está equipado con dos brazos abiertos y dos cerrados y elevado a una altura de unos 50 cm sobre el suelo. Al principio de cada prueba, el ratón se colocaba en el cuadrado central mirando hacia el brazo abierto y luego se le permitía explorar los brazos durante 5 minutos. La cantidad de tiempo que pasó en los brazos abiertos fue registrada y analizada por una persona que no participó en el diseño experimental.
2.6. Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Medimos el nivel de IL-6 en los tejidos cerebrales utilizando un kit comercial de ELISA (eBioscience, Thermo Fisher Scientific). Cada muestra se ensayó por duplicado con las diluciones adecuadas para que las unidades luminiscentes relativas pudieran estar dentro del rango lineal de las curvas estándar. El valor de la IL-6 de cada muestra se normalizó y se expresó como una relación comparada con la proteína de carga total como una relación relativa. La absorbancia de cada muestra se midió con un lector de microplacas (Synergy Mx, BioTek, Winooski, VT).
2.7. Western Blot
Las muestras cerebrales disueltas se procesaron y corrieron en geles de SDS-PAGE. A continuación se transfirieron a membranas de PVDF que luego se bloquearon con leche desnatada al 5% en tampón TBST. Las membranas bloqueadas se investigaron posteriormente con anticuerpos contra CD11b (1 : 4000; Abcam, Reino Unido), sinaptofisina (SYP), p-Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA), y Stat-3 total (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA) en leche TBST durante la noche a 4°C. Tras la incubación con los anticuerpos secundarios durante 2 horas a temperatura ambiente respectivamente, las bandas de proteína en la membrana se revelaron con reacción de quimioluminiscencia. Se utilizó la β-actina como control interno (1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Los resultados cuantitativos se expresaron como una relación de cada proteína objetivo con su β-actina.
2.8. Análisis estadístico
Los valores presentados en el estudio se mostraron como la. La significación de la diferencia entre dos grupos se determinó mediante el análisis de la prueba de Student. Un valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
3.1. La exposición a una dosis única de propofol provocó comportamientos de tipo depresivo en ratones con pruebas de suspensión de la cola y natación forzada
En primer lugar, comprobamos la hipótesis de si una dosis única de tratamiento con propofol podría causar efectos a largo plazo en el rendimiento conductual de los ratones centrándonos en el modo de depresión. Empleamos las pruebas de suspensión de la cola y de natación forzada en estos ratones para explorar los efectos a largo plazo del propofol. En la prueba de suspensión de la cola, descubrimos que el propofol aumentaba significativamente el tiempo de inmovilidad en comparación con los ratones de control sin tratamiento con propofol cuando los ratones estaban colgados de la cola (Figura 1). Para confirmar aún más el comportamiento depresivo de los ratones expuestos al propofol, utilizamos el método de natación forzada para medir el tiempo de inmovilidad de estos ratones. Nuestros resultados demostraron que el propofol aumentó el tiempo total de inmovilidad en comparación con los ratones del grupo de control (Figura 2). Estos hallazgos anteriores revelaron que una sola dosis de tratamiento con propofol podría causar y mantener el rendimiento conductual depresivo a largo plazo en los ratones.
3.2. La exposición a una dosis única de propofol provocó comportamientos similares a la ansiedad en ratones con pruebas de campo abierto y laberinto elevado
La ansiedad es la complicación de mayor coocurrencia en la depresión. Por lo tanto, postulamos si el propofol podría inducir comportamientos similares a la ansiedad en estos ratones, basándonos en los resultados conductuales anteriores en estos ratones. Utilizamos el ensayo de campo abierto para comprobar el nivel de ansiedad de estos ratones. Como se muestra en la Figura 3(a), el tratamiento con propofol redujo efectivamente el tiempo total que los ratones pasaron en el área central en el campo abierto. Y también medimos otro parámetro importante de la prueba, la distancia total de desplazamiento de los ratones. Como esperábamos, la inyección de propofol disminuyó significativamente la distancia de desplazamiento de los ratones en la sesión de prueba de 5 minutos en comparación con los ratones de control (Figura 3(b)). A continuación, investigamos los comportamientos de ansiedad de estos ratones en el ensayo del laberinto elevado. Encontramos que los ratones expuestos a propofol mostraban un tiempo significativamente menor en brazos abiertos (Figura 4), lo que coincidía con los resultados del ensayo de campo abierto.
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3.3. La exposición a una dosis única de propofol provocó el aumento del nivel de IL-6 en los tejidos cerebrales de los ratones
Un estudio reciente sugirió la implicación de la neuroinflamación en los déficits cognitivos similares al delirio postoperatorio . Probamos si el propofol podía influir en el nivel de expresión de la IL-6 en los tejidos cerebrales de estos ratones. Para llegar a esta conclusión, realizamos un ensayo ELISA en los tejidos cerebrales (hipocampo y corteza) para evaluar el nivel de IL-6 en ratones con o sin tratamiento con propofol. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con propofol en esta condición podría ser capaz de regular al alza el nivel de expresión de esta citoquina en los cerebros de los ratones expuestos al propofol (Figura 5). Este resultado indicaba que el propofol podría causar los comportamientos de ansiedad y depresión en los ratones al afectar a la respuesta inflamatoria en sus cerebros.
3.4. La exposición a una dosis única de propofol provocó la reducción de la expresión de CD11b y el aumento de la expresión de p-STAT-3 en los tejidos cerebrales de los ratones
Por último, sondeamos los posibles mecanismos celulares y moleculares que podrían ser responsables de los cambios de comportamiento en estos ratones expuestos al propofol. Comprobamos si las células gliales se veían influidas por el tratamiento con propofol observando la proteína creadora de microglía, CD11b. Con un estudio de western blot, encontramos que el nivel de expresión de CD11b se redujo en los cerebros de los ratones con tratamiento de propofol (Figura 6(a)), lo que sugirió que la función microglial podría estar regulada por el tratamiento de propofol. Mientras tanto, la expresión de la proteína presináptica SYP no se vio afectada por el tratamiento con propofol (Figura 6(c)). También estudiamos la función del factor transcripcional STAT-3 investigando el estado de fosforilación de STAT-3 (p-STAT-3). Nuestros resultados de western blot demostraron que el tratamiento con propofol provocó un aumento del nivel de expresión de p-STAT-3 sin afectar a la expresión de STAT-3 total (Figura 6(b)). Estos hallazgos implican que el propofol podría influir en la función de las células microgliales y potenciar la fosforilación de STAT-3 al tiempo que induce los comportamientos de ansiedad y depresión en los ratones.
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4. Discusión
Las disfunciones cognitivas y de memoria han sido bastante estudiadas, pero la fluctuación del estado de ánimo postoperatorio no ha atraído suficiente atención hasta ahora. Algunas evidencias apoyaban la idea de que había cambios significativos en el estado de ánimo que se producían en los pacientes expuestos a la cirugía y al tratamiento anestésico. Aquí, probamos una nueva hipótesis de que el tratamiento anestésico per se puede ser suficiente para afectar significativamente el estado de ánimo en animales que se sometieron a la dosis única de tratamiento anestésico sin un procedimiento quirúrgico acompañante. Utilizamos propofol como compuesto anestésico representativo y lo inyectamos por vía intraperitoneal a los ratones. En los días siguientes, se realizaron una serie de comportamientos depresivos y de ansiedad para observar los cambios de humor en los ratones. Descubrimos que había diferencias significativas en los comportamientos de estos ratones con o sin exposición al propofol. Dado que estos efectos inducidos por el propofol se mantuvieron durante un tiempo significativo incluso después de que se retirara la medicación, postulamos que estos efectos no eran la influencia anestésica aguda sino que estaban mediados por otros sistemas en el SNC.
Se ha descubierto que la neuroinflamación es uno de los principales factores que contribuyen a la depresión y a otros cambios de humor en el SNC. Aquí, nos preguntamos si una célula microglial se activó en el cerebro de los ratones después de la exposición al propofol. El marcador de proteína de la célula microglial, CD11b que es una de las proteínas marcadoras comunes para demostrar la activación de la microglía, se investigó con western blot. Sorprendentemente, nuestros resultados indicaron que el propofol podía inhibir el nivel de proteína de CD11b. La explicación plausible aquí es que el propofol podría inhibir la expresión de la proteína CD11b independientemente de si las células microgliales estaban activadas o no. El destacado avance del propofol puede ser importante para el tratamiento potencial de aliviar la sobreactivación microglial en algunas condiciones patológicas del SNC, como el trauma, el accidente cerebrovascular y la esclerosis múltiple. También examinamos el efecto del propofol en las proteínas sinápticas, que son factores fundamentales muy importantes para el comportamiento de los animales. Curiosamente, aunque el propofol podía afectar a la función de las células microgliales, no parecía afectar al nivel de expresión de las proteínas sinápticas. Estos resultados no coinciden con algunos informes anteriores. La posible razón puede deberse a la diferencia de la ventana de tiempo en la que se recogieron las proteínas después de la administración de propofol. Pero nuestros hallazgos aún sugieren que el propofol podría tener un impacto diferente en las neuronas y en otras células gliales. En el estudio futuro, los efectos del propofol en las células gliales y neuronales deberían elaborarse individualmente.
La respuesta neuroinflamatoria en el SNC expuesto a la dosis única de propofol se validó además mediante la prueba ELISA de IL-6 en estos dos grupos de ratones. Descubrimos que el tratamiento con propofol podía inducir un aumento de la IL-6 en el cerebro de los ratones. Estos hallazgos estaban en consonancia con los resultados del propofol en la función de las células microgliales. Al tiempo que inhibe el componente CD11b, el propofol puede activar las vías de señalización pertinentes que son importantes para la activación de las células microgliales.
En conjunto, nuestro estudio sugirió que el propofol era capaz de influir en la función de las células microgliales y exacerbar la respuesta inflamatoria en el SNC. La reacción celular y molecular podría ser responsable de los cambios de comportamiento en estos ratones administrados con la dosis única de propofol. Nuestro estudio destacó el importante papel de los anestésicos en el impacto de los cambios de humor después de la operación, pero el estado de ánimo podría verse afectado significativamente por muchos factores, incluyendo la inflamación que se observa con bastante frecuencia en los pacientes durante y después de la cirugía. Por lo tanto, se justifica para el futuro una serie de estudios sistémicos bien diseñados en un modelo animal que incluya no sólo los anestésicos, sino también el procedimiento quirúrgico.
Disponibilidad de datos
Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud.
Conflictos de intereses
Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo financiero del Departamento de Ortopedia, Hospital Municipal de Qingdao, Qingdao, Shandong, China, y el apoyo técnico de la Universidad Médica de Weifang, Weifang, China.