Este estudio se basa en un sistema de membrana muy querido por K. R. Porter: el retículo sarcoplásmico (RS) de las fibras musculares estriadas. Porter bautizó apropiadamente el abundante sistema de membranas que rodea estrecha y completamente las miofibrillas en todas las células musculares como el RS, basándose en su ubicación (sarcoplásmico) y en su estructura general como una extensa red (retículo). En sus descripciones del RE, iniciadas en colaboración con H. S. Bennett (1-3), Porter reconoció dos aspectos importantes de este sistema de membrana. El primero es que el RE es simplemente una expresión especializada del retículo endoplásmico (RE) que impregna todos los tipos de células, y el segundo es que la disposición precisa del RE en relación con las miofibrillas indica su papel en algún aspecto del control de la contractilidad. Ambas ideas de Porter están ahora plenamente confirmadas. Se sabe que el RE se desarrolla inicialmente como un RE que contiene la variedad habitual de proteínas genéricas del RE y que, a medida que la célula muscular se diferencia, se enriquece enormemente en proteínas específicas del RE (4, 5). Las tres proteínas que se purificaron por primera vez del RE son la ATPasa de calcio o la proteína de la bomba de calcio, responsable del bombeo de calcio al lumen del RE durante la relajación (6); la calsequestrina, la proteína de baja afinidad de unión al calcio que aumenta en gran medida la capacidad del lumen del RE para el calcio (7); y el receptor de rianodina (RyR), responsable de la liberación de calcio durante la activación del músculo (véase la referencia 8 para una revisión). Más tarde se descubrió que todos los tipos de células contienen formas y/o análogos específicos de estas tres proteínas que son responsables del manejo del calcio. En todas las células, estas proteínas tienden a estar agrupadas. El SR es, pues, un dominio extenso y especializado del RE de las células musculares. Por el contrario, todas las células contienen dominios especializados similares al SR, pero en cantidades mucho menores. Algunas células no musculares, como las células de Purkinje del cerebelo, tienen en realidad extensos dominios similares al SR que contienen isoformas específicas del músculo de RyRs y calsequestrina (9, 10).
Como Porter, en su inimitable estilo, escribió: «la precisa relación morfológica del retículo con las miofibrillas…. hace pensar que el sistema es funcionalmente importante en la contracción muscular». La comprensión de la función específica del RE en el control de la contracción muscular fue conformada por publicaciones críticas en el emocionante período que precedió y siguió inmediatamente a las descripciones de Porter sobre el RE. Los experimentos de estimulación local de A. F. Huxley, realizados a finales de los años cincuenta y principios de los sesenta, indicaron la presencia de una vía específica que permitía la propagación del evento eléctrico en el interior de la fibra y, por tanto, proporcionaron un vínculo crucial entre la despolarización de la superficie y la rápida activación de las miofibrillas localizadas en el centro (véase la referencia 11 para una revisión). El artículo seminal de A. Weber de 1959 aportó la primera prueba de que los iones de calcio, ahora plenamente reconocidos como mensajeros intracelulares generales, son responsables del control de la contracción muscular (12). S. Ebashi y A. Weber se influyeron mutuamente a través de los continentes en la construcción de pruebas claras de que la capacidad de secuestro de calcio del RE explica plenamente la relajación, mientras que W. Hasselbach definió con precisión la acción de bombeo de calcio del RE (véase la ref. 13 para una revisión).
Al haber seguido de cerca a L. D. Peachey en el laboratorio de Porter, era plenamente consciente de la búsqueda, iniciada por los resultados de A. F. Huxely, de un enlace entre el plasmalema de la fibra muscular y su interior que permitiera una rápida propagación del evento eléctrico hacia el interior de la fibra (14). En su artículo de 1957 (3), Porter y Palade habían descrito una unidad estructural repetitiva, la tríada, que se sitúa en relación precisa con las bandas de las miofibrillas: bien frente a la línea Z, bien frente a la unión A-I. La tríada se compone de 2 cisternas de SR estrechamente enfrentadas a un túbulo central. La localización de la tríada (3) y de su túbulo central (15-17) coincide con los lugares en los que se produce la propagación hacia el interior de las contracciones resultantes de la despolarización local (11). Utilizando minuciosos cortes seriados, Andersson-Cedergren (18) demostró que los elementos centrales de la tríada forman una red continua a través de las fibras musculares, de ahí el nombre de túbulos transversales (T) para estos componentes de la tríada. Así pues, los ojos de los microscopistas electrónicos se centraron en los túbulos T, y yo estaba preparado para el descubrimiento que me recibió hacia el final de mi periodo de formación posdoctoral en el laboratorio de Porter (1963). Estaba observando secciones finas de músculo esquelético de guppys que habían sido criados en los tanques de Elisabeth Porter y de repente vi ejemplos repetidos de bocas muy abiertas de túbulos T en el borde de la fibra. Fue fácil llamar la atención de Porter: Entré en su laboratorio a las 22:00-11:00, el final habitual de su jornada laboral, cuando podía relajarse, y le mostré mis negativos. El interés de Porter se despertó inmediatamente. Mis imágenes no estaban a su altura, así que cogió uno de mis bloques, cortó personalmente secciones finas y tomó una serie de micrografías, cada una de ellas una obra de arte (Fig. 1A). Las micrografías de Porter constituyeron la mayor parte de las ilustraciones de la publicación final, mostrando que los túbulos T tienen las características esenciales necesarias para su papel en la propagación de la despolarización de la membrana superficial hacia el interior de la fibra (19, véase también la Fig. 1B). La continuidad del lumen de los túbulos T con los espacios extracelulares también se confirmó en el mismo año mediante la penetración de trazadores del espacio extracelular (20, 21) y de un colorante fluorescente (22). La continuidad de los túbulos T con la membrana superficial está en la base de la gran capacitancia de la membrana superficial de las fibras musculares.
Los dominios funcionales del SR se asocian bien con la membrana superficial o con los túbulos T (Figs. 1C, G), formando con ellos uniones bien definidas denominadas unidades de liberación de calcio (ver 23, 24 para revisiones). Durante el acoplamiento excitación-contracción (e-c), las membranas exteriores se despolarizan inicialmente, e inmediatamente después el RS libera calcio en los espacios miofibrilares. La cuestión estructural se convierte entonces en: ¿cuál es la relación entre el RE y las membranas exteriores en estos sitios de unión especializados que permite traducir el evento eléctrico en la liberación de calcio del RE durante la activación muscular? Saltando hacia adelante en el tiempo por ∼25 años, la pregunta estructural moderna con respecto a este paso en el acoplamiento e-c es: ¿cuál es la relación espacial entre las proteínas del SR y de las membranas exteriores en las unidades de liberación de calcio, y qué se puede deducir de esta asociación? Cuatro proteínas del SR de la unión están bien identificadas: los receptores de rianodina (RyRs), o canales de liberación de calcio del SR (8); la calsequestrina (7, 25); la triadina (26); y la junctina (27). Los RyRs son canales de calcio homotetraméricos constituidos por 4 subunidades idénticas con un gran dominio citoplasmático y una masa combinada de ∼2.000 kDa, que, cuando se abren, permiten un rápido escape del calcio del SR hacia los espacios miofibrilares. Los dominios citoplasmáticos de los RyRs son visibles en el microscopio electrónico como pies que conectan la superficie de unión del SR con las membranas exteriores (Fig. 1C, D). Los RyRs están así estratégicamente situados para interactuar con la membrana superficial. La calsequestrina es una proteína luminal de las cisternas del RS, localizada en las proximidades de los dominios de unión del RS (Figs. 1B, C). Su función es aumentar la capacidad total de calcio del lumen del RE, manteniendo una concentración de calcio libre relativamente alta, permitiendo así un gran gradiente de concentración de calcio iónico entre el lumen del RE y las miofibrillas. La triadina es probablemente la proteína que une la calsequestrina a la superficie del RE, manteniéndola en la proximidad de los RyR, y la junctina puede tener también un papel similar. Cualquiera de estas dos últimas proteínas, u otras aún no identificadas, es responsable de mantener la calsequestrina inmovilizada en las proximidades de los canales de liberación de calcio. Una proteína de membrana superficial se localiza en los dominios de unión de las membranas exteriores que participan en las unidades de liberación de calcio (23): el canal de calcio tipo L, también llamado receptor de dihidropiridina (DHPR). Los DHPR actúan como sensores de voltaje además de como canales de calcio, y su acción es necesaria para iniciar la liberación de calcio desde el SR (28, 29).
En el músculo esquelético, los DHPRs se agrupan en tétradas, o grupos de 4 componentes localizados en las esquinas de pequeños cuadrados (Figs. 1E, I). Las tétradas de DHPRs forman conjuntos ordenados que se enfrentan a conjuntos ordenados de los pies del SR de tal manera que cada una de las 4 DHPRs que componen la tétrada parece estar vinculada a una subunidad de un pie subyacente (30, 31). Esta relación estructural directa de las 2 principales proteínas de la unidad de liberación de calcio ayuda a apoyar la llamada hipótesis «mecánica» del acoplamiento e-c, que propone que los sensores de voltaje en la membrana del túbulo T (que más tarde se demostró que eran las DHPRs) perciben la despolarización y afectan a la liberación de calcio del SR mediante una interacción molecular directa (32). Una de las observaciones estructurales desconcertantes respecto a la relación DHPR-RyR es que las tétradas se asocian con pies alternativos (Fig. 1 M), dejando un conjunto de pies huérfanos (o RyRs) que no están directamente vinculados a las DHPRs. El trabajo comparativo en una variedad de músculos in vivo e in vitro indica que la disposición alterna es la regla para el músculo esquelético, y no depende de la presencia de 2 tipos de isoformas de RyR.
La exploración reciente de las bases moleculares y de desarrollo de la relación DHPR-RyR es el trabajo de dos becarios postdoctorales en mi laboratorio (Drs. Hiroaki Takekura y Feliciano Protasi) e implica colaboraciones con los Drs. P. D. Allen, K. G. Beam, B. E. Flucher y H. Takeshima. La primera cuestión que nos planteamos es cómo se produce la disposición alterna de las tétradas durante el desarrollo de las uniones. Esta cuestión se exploró en colaboración con el Dr. B. E. Flucher utilizando células de origen muscular esquelético en la línea celular BC3H1, que desarrollan agrupaciones co-localizadas de DHPRs, triadina y RyRs en la periferia celular (33). Las secciones delgadas y la fractura por congelación de estas células muestran unidades de liberación de calcio bien diferenciadas que contienen extensas matrices ordenadas de pies y tétradas. Las tétradas tienen una disposición alterna. Muchas de las uniones tienen tétradas con elementos ausentes, y dado que las encontramos tanto en los primeros como en los últimos días de cultivo, suponemos que muchas representan uniones en proceso de formación. Curiosamente, incluso cuando están bastante incompletas, las matrices de tétradas tienen la disposición alternativa en relación con las matrices de pies, lo que indica que esta relación es intrínseca a las interacciones entre las 2 proteínas.
La segunda cuestión es si la agrupación de DHPRs en tétradas es exclusiva del músculo esquelético o está presente en músculos que parecen tener una base diferente para el acoplamiento e-c. El músculo cardíaco contiene isoformas de RyRs y DHPRs diferentes a las del músculo esquelético, y difieren funcionalmente en que la permeación de calcio a través de las DHPRs parece ser un requisito para el acoplamiento e-c (34, 35). Las DHPRs y los RyRs del músculo cardíaco se localizan en sitios que parecen co-localizados a nivel del microscopio de luz (Fig. 1F), al igual que en el músculo esquelético, y esta yuxtaposición se logra temprano en la diferenciación del aparato de acoplamiento e-c (36-38). Sin embargo, la fractura por congelación muestra que la disposición de las DHPRs en el músculo cardíaco es distinta a la del músculo esquelético (comparar Figs. 1I, K). Las DHPRs están en la proximidad de los pies pero no parecen estar directamente unidas a ellos (Fig. 1N) por lo que su interacción puede ser indirecta, a través de un transmisor (por ejemplo, el calcio).
La información anterior es directamente relevante para entender 2 modelos de ratón para el estudio del acoplamiento e-c. En un modelo falta la subunidad principal (α1) de las DHPRs esqueléticas. Los músculos no se contraen debido a la falta de acoplamiento e-c y se desarrollan mal (de ahí el término disgenia). Sin embargo, se forman tríadas que contienen conjuntos de pies, lo que indica que la presencia de RyRs no es necesaria para la formación de uniones SR-superficie. Los grupos de DH-PRs (detectados por inmunomarcación) y las tétradas de DHPR (detectadas por congelación) faltan en las células musculares disgenicas, pero se restauran por transfección de miotubos disgenicos cultivados con cDNA para la DHPR, demostrando que las tétradas están compuestas por DHPRs (31, 39, 40). El otro modelo es una mutación nula dirigida del RyR de tipo esquelético, que también resulta en el bloqueo del acoplamiento e-c. Las fibras musculares que carecen de RyR, inesperadamente, forman tríadas (41) (Fig. 1H). Las tríadas no tienen pies, de ahí el término dispedia, pero por lo demás parecen normales en secciones delgadas. Una línea celular (1B5) desarrollada a partir de una mutación dispédica también carece de acoplamiento e-c. Utilizando estas células, hemos demostrado que, a pesar de la ausencia de pies, se forman uniones superficiales de SR dispédicas que contienen triadina y DH-PRs (42). Sin embargo, en la fractura por congelación los grupos de DHPRs localizados en las uniones dispédicas no se agregan en tétradas (Fig. 1L). La expresión del cDNA que codifica el RyR de tipo 1 del músculo esquelético en las células 1B5 da lugar a la formación de manchas de RyR localizadas periféricamente (Fig. 1P) y a la agrupación de DHPR en tétradas (Fig. 1Q). Por lo tanto, las DHPRs no necesitan la presencia de RyRs para agruparse en los sitios de unión de la superficie del SR, pero sí necesitan una interacción con los RyRs esqueléticos para formar tétradas. Esto también confirma indirectamente que existe un vínculo entre los RyR y los DHPR en las fibras musculares esqueléticas. Por el contrario, la ausencia de tétradas en el músculo cardíaco indica que, o bien no existe un enlace RyR-DHPR, o bien el enlace es diferente al del músculo esquelético. Tanto la presencia del enlace RyR-DHPR como su ausencia o diferencia tienen profundas implicaciones funcionales para el acoplamiento e-c. K. R. Porter habría aprobado estos desarrollos en nuestra comprensión del SR, porque se basan en relaciones estructura-función precisamente definibles.