Resultados
Estructura global de la proteína Ivy de E. coli .
La proteína codificada por el gen ykfE fue expresada y purificada en el contexto de un proyecto de genómica estructural dirigido sistemáticamente a genes de E. coli de función desconocida. Por casualidad, se descubrió que la proteína YkfE se copurificaba y cocristalizaba con la HEWL utilizada en el protocolo rutinario de disrupción bacteriana. La proteína YkfE se caracterizó posteriormente como un potente y específico inhibidor de la lisozima de tipo C (7), y el nombre del gen se cambió a Ivy (inhibidor de la lisozima vertebrada) para reflejar esta propiedad. Se han obtenido estructuras cristalinas de alta resolución para E. coli Ivy (Ivyc) tanto en aislamiento como en complejo con lisozima.
Vistas estereoscópicas de la estructura de Ivyc. (a) Trazado Cα del monómero de Ivyc (residuos 2-128). (b) Estructura de cinta del dímero de Ivyc.
La estructura de Ivyc. (a) Representación en dibujos animados del complejo Ivyc-HEWL. Los monómeros del dímero de Ivyc están coloreados en azul y rojo, y las dos moléculas de lisozima están coloreadas en naranja. Los residuos H60 de Ivyc responsables de la inhibición de HEWL se representan como bolas y palos de color azul claro. El residuo D52 de HEWL está coloreado en amarillo, y el E35 está en púrpura con representación de bolas y palos. Estos dos residuos forman parte del sitio activo del HEWL y establecen enlaces de hidrógeno con los residuos H60 del Ivyc. Las flechas negras delinean la superficie de contacto entre el dímero de Ivyc y cada molécula de lisozima. (b) Representación cartográfica de la superposición de las moléculas de Ivy en la estructura del complejo (rojo y rosa) y de las tres moléculas de Ivyc aisladas (amarillo, azul, morado) superpuestas con una molécula de Ivyc del complejo (rojo). Los elementos de la estructura secundaria están marcados en la estructura. (c) Vista estereoscópica del mapa de densidad electrónica del bucle saliente de Ivyc que penetra en el sitio activo de HEWL. El mapa de densidad electrónica de dos F o – F c está contorneado a 1,0 σ. Los residuos están coloreados por tipos: residuos básicos en cian, residuos ácidos en rojo, residuos polares en verde claro, residuos hidrofóbicos en amarillo, residuos de cisteína en verde y residuos aromáticos en púrpura. El Ivyc H60 y el HEWL E35 y D52 están marcados. (d) Interacción del bucle de Ivyc (CKPHDC) con el sitio activo de la lisozima. Ivyc se representa como un lazo azul; H60, C57 y C62 son bolas y palos amarillos; y el sitio activo de la lisozima como superficie molecular se colorea según los tipos de residuos (ácidos, rojo; polares, verde; hidrofóbicos, blanco; básicos, azul).
Descripción de la estructura.
Previamente demostramos mediante filtración en gel y estudios de fluorescencia que el homodímero periplásmico de Ivyc es la unidad fisiológicamente activa, con un K d de dimerización en el rango de 10-9 M (7). La proteína Ivyc cristalizó como un dímero. La unidad asimétrica cristalina contiene tres moléculas correspondientes a un dímero no cristalino y a un monómero. Aplicando la simetría cristalográfica, este monómero reconstruye el dímero fisiológico. Cada monómero consta de una lámina β central formada por cinco filamentos β antiparalelos flanqueados en el lado convexo por dos hélices cortas (α1, α2; seis y ocho residuos, respectivamente) y, en el lado cóncavo, por una hélice anfipática (α4; 11 residuos) (Fig. 1). Buscamos homólogos estructurales de este dominio utilizando el programa DALI (8). La mejor coincidencia estructural en el PDB es la histona acetiltransferasa de 306 aa (código PDB 1BOB) de la levadura (Z = 5,2), con sólo un 9% de residuos idénticos a lo largo de 89 aminoácidos y una dMS de 4,0 Å. Sin embargo, la topología de las dos estructuras es marcadamente diferente, por lo que la estructura de Ivy es un pliegue novedoso. La estructura del dímero presenta un pliegue en forma de herradura centrado en las dos hélices anfipáticas antiparalelas (α4) (Fig. 1 b). En el cristal, hay 1.605-Å2 de superficie enterrada entre los dos monómeros relacionados por el eje de los 2 pliegues cristalográficos (monómero A) y 1.432-Å2 de superficie enterrada entre los dos monómeros relacionados por el eje de los 2 pliegues no cristalográficos (monómeros B y C). La diferencia media entre los tres monómeros oscila entre 0,547 Å (B/C) y 0,865 Å a lo largo de 122 residuos (A/B) según la superposición Cα. La estructura revela que el dímero implica interacciones entre las espinas dorsales y las cadenas laterales de los residuos todos reunidos en la parte C-terminal de la molécula en la cadena β6 y las hélices α4 y α5 (Fig. 2 b). Estos residuos se conservan en varias cepas de E. coli, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae y secuencias homólogas de Burkholderia cepacia, lo que sugiere que la proteína Ivy es un dímero funcional en estas bacterias y probablemente monomérico en las demás bacterias que contienen Ivy.
Mecanismo de inhibición de la lisozima: La estructura del complejo Ivyc-HEWL (Código PDB 1GPQ).
La unidad asimétrica cristalina contiene un homodímero no cristalino de Ivyc en complejo con dos moléculas de HEWL. Hay dos tipos de interacciones Ivyc/HEWL: la interacción principal que implica una superficie enterrada de 969-Å2 entre un monómero de Ivyc y una molécula de HEWL, y una interacción secundaria que implica una superficie enterrada de 552-Å2 entre el segundo monómero de Ivyc y la misma molécula de HEWL, creando así una superficie enterrada de 1.340-Å2 entre el homodímero de Ivyc y la primera molécula de HEWL (Fig. 2 a). Para el segundo monómero de HEWL, la superficie enterrada es de 1.043 Å2 para la interacción principal y de 623 Å2 para la interacción secundaria, lo que lleva a un total de 1.361-Å2 de superficie enterrada entre el homodímero de Ivyc y la segunda molécula de HEWL.
La estructura del complejo confirma la estequiometría experimental de la interacción entre Ivyc y HEWL (7) y sugiere inmediatamente el mecanismo de inhibición de la lisozima por la molécula de Ivyc. Mediante la formación del complejo Ivyc/HEWL, el sitio activo de la lisozima queda ocluido por un bucle que sobresale de la molécula de Ivyc (Fig. 2 c y d). En el centro de este bucle, un residuo de histidina (H60) establece enlaces de hidrógeno con dos de los tres residuos responsables de la actividad enzimática de la lisozima (D52 y E35). La molécula de lisozima complejada con Ivyc no presenta ningún cambio estructural significativo (rmsd ≈0,5 Å sobre 127 residuos basado en la superposición Cα de 1HEL con las moléculas de lisozima en el cristal). Sin embargo, se excluye una molécula de agua del sitio activo de la lisozima y se sustituye por la histidina del bucle inhibidor de Ivyc.
La comparación de las estructuras refinadas de Ivyc aislada o complejada con HEWL (Fig. 2 b y Tabla SI 2) revela algunos cambios conformacionales menores. Estos incluyen la orientación de la hélice pequeña (α3) en los tres monómeros de la forma libre de Ivyc. La orientación observada en la molécula A es la más cercana a la observada en el dímero de Ivyc complejado con HEWL. Tres hélices de 310 (η1, η2 y η3) observadas en la estructura de Ivyc/HEWL están ausentes en las tres moléculas de Ivy no complejas. Más sorprendentemente, el bucle de Ivy que sobresale e interactúa directamente con el sitio activo de la lisozima no presenta un cambio conformacional notable entre las dos formas cristalinas. La rigidez de este bucle bastante corto puede explicarse por la presencia de un enlace disulfuro (C57-C62) y un puente salino entre el residuo de lisina (K58) junto a la primera cisteína y el residuo de aspartato (D61) junto a la segunda cisteína. Estas restricciones estructurales que sugieren una interacción de tipo llave-cerradura con las lisozimas de tipo C podrían explicar la estricta conservación de la secuencia del bucle entre un subconjunto de homólogos de Ivy (ortólogos de Ivyc) incluso en bacterias lejanamente relacionadas (Fig. 3 y SI Fig. 5).
Análisis filogenético de la familia de proteínas Ivy. El árbol filogenético sugiere que un ancestro de Ivyc existió tanto en la división gamma como en la beta (en amarillo), pero que posteriormente se perdió en algunos de los clados de la división gamma (por ejemplo, Salmonella) y beta (por ejemplo, la mayoría de las Neisseriaceae y Bordetella). La posición anómala de la rama que lleva a las pocas especies alfa (en rojo) en las que se identifica Ivy sugiere fuertemente una adquisición por transferencia horizontal desde Enterobacteria, como fue probablemente el caso de B. cepacia (pérdida del gen derivado de Burkholderia, adquisición desde Enterobacteria). Las secuencias paralógicas de Ivyc que exhiben el motivo de bucle no canónico (en verde) parecen haber surgido de una duplicación dentro y limitada al clado de Pseudomonas (seguida de la pérdida del ortólogo original de Ivyc, excepto para P. aeruginosa).
Estudios funcionales: Caracterización de mutantes de ΔIvy E. coli.
El papel central del bucle CKPHDC en la inhibición fue validado experimentalmente mediante mutagénesis dirigida. Se realizaron sustituciones de aminoácidos para evaluar la influencia de algunos de los residuos clave que interactúan, tal y como sugiere la estructura del complejo Ivyc/HEWL. Como era de esperar, observamos una menor actividad inhibidora para los mutantes de histidina (H60). El efecto más drástico (aumento de 300 veces en K i) se observó al introducir un residuo aspártico cargado negativamente en esta posición (SI Tabla 3). Este efecto se debe probablemente a una interacción repulsiva con los dos residuos ácidos del sitio activo de la lisozima (D52 y E35). Por otro lado, no se observó ningún cambio significativo en la actividad inhibidora al introducir una mutación C62 → A62 que interrumpía el puente disulfuro.
Realizamos un knockout del gen ivy de E. coli para evaluar el efecto protector in vivo de la proteína Ivy en presencia de lisozima. El único knockout del gen ivy en E. coli no mostró un fenotipo de mayor sensibilidad a HEWL, confirmando así que, en condiciones de laboratorio, la lisozima no penetra en la pared bacteriana (9). A continuación, construimos un doble mutante introduciendo una deleción TolB-pal para reproducir el fenotipo de «pared celular porosa» descrito anteriormente (10). Anteriormente se demostró que los mutantes de E. coli ΔtolB presentan un fenotipo típico de sensibilidad a los fármacos y detergentes, fugas y formación de vesículas en la membrana externa (10, 11), debido a una síntesis deficiente de la envoltura. Hemos medido la sensibilidad a la lisozima del doble mutante ΔtolBΔivy con referencia al mutante ΔtolB (JC864). En condiciones de laboratorio, el mutante ΔtolB resultó ser sensible a concentraciones de lisozima superiores a las encontradas en las secreciones (>50 μg-ml-1; SI Fig. 6), demostrando así que las moléculas del tamaño de una proteína, además de las pequeñas, pueden penetrar en esas células de E. coli con fugas. A continuación, se probó el mutante ΔtolBΔivy y se comprobó que presentaba una mayor sensibilidad a HEWL, ya que para concentraciones fisiológicas (50 μg-ml-1; Fig. 4 a) el efecto de la lisozima sobre el crecimiento bacteriano ya era visible, lo que apoya el papel protector de Ivyc. Este efecto protector se confirmó además al sobreexpresar Ivyc en un mutante doble ΔtolBΔivy que portaba un plásmido de expresión inducible por β-d-tiogalactósido (Fig. 4 b), donde la expresión de Ivy fue capaz de restaurar el crecimiento bacteriano para concentraciones de lisozima de hasta 500 μg-ml-1. También se han descrito resultados similares en el contexto de otros tratamientos permeabilizantes (9).
Efecto de concentraciones crecientes de HEWL sobre la cinética de crecimiento de los mutantes de E. coli. (a) E. coli MG1655 ΔtolBΔivy. (b) E. coli MG1655 ΔtolBΔivy transformada con el plásmido pET26 que expresa la proteína Ivyc en el periplasma. Para E. coli MG1655 ΔtolB (JC864) como control ver SI Fig. 6.
La familia de proteínas Ivy: Distribución filogenética.
Se realizó una búsqueda exhaustiva de homólogos de la proteína Ivy de E. coli utilizando todos los datos de secuencias accesibles al público, incluyendo las secuencias completas del genoma bacteriano y los datos de los proyectos de secuenciación en curso de los principales centros de secuenciación del genoma (ver Materiales y Métodos). Todas las secuencias homólogas de Ivy identificadas se utilizaron iterativamente como consultas para optimizar la detección de parientes evolutivamente más distantes. Se identificaron un total de 35 secuencias homólogas a Ivy distintas (que iban del 100% al <25% de identidad de secuencia con la proteína Ivy de E. coli K12). Sorprendentemente, los homólogos de Ivy sólo se identifican en miembros de las Proteobacterias (bacterias Gram-negativas), y se predice que todos ellos son periplásmicos (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Por un lado, puede parecer lógico que las proteínas Ivy se coloquen con la fracción de proteoglicano (el sustrato de la lisozima) dentro del compartimento periplásmico. Por otro lado, se cree que la red de proteoglicanos está físicamente protegida del ataque de las enzimas exógenas por la pared celular de las Proteobacterias y no se considera un sustrato natural para la lisozima. La presencia de un gen que codifica un inhibidor de la lisozima en las bacterias Gram negativas y no en las Gram positivas es, pues, una paradoja. El árbol filogenético de los homólogos de Ivy se presenta en la Fig. 3, según las divisiones estándar de Proteobacteria (12): alfa, beta, gamma, delta y épsilon. A día de hoy, la familia de proteínas Ivy está más representada en las divisiones gamma y beta, pero se han identificado inequívocamente dos homólogos de Ivy en dos especies no relacionadas de la división alfa: Parococcus denitrificans y Gluconobacter oxydans. Dentro de las divisiones gamma y beta, los homólogos de Ivy están distribuidos de forma esporádica. Por ejemplo, los homólogos de Ivy están presentes en todas las Enterobacterias, excepto en Salmonella, pero también se encuentran en todas las Pseudomonadáceas secuenciadas. Del mismo modo, en la división beta, los homólogos de Ivy se encuentran en todas las Burkholderia, se identifican en una sola especie de Neisseriaceae y están ausentes en muchos otros genomas secuenciados de esta división. Esta distribución esporádica de la familia de proteínas Ivy denota una compleja historia evolutiva subyacente hecha de pérdidas genéticas diferenciales a través de clados superpuestos con eventos de transferencias horizontales, como sugiere el análisis filogenético detallado (Fig. 3). Excepto en el caso de las alfaproteobacterias, la mayoría de las especies que albergan ortólogos de Ivyc son patógenos o patógenos oportunistas para el ser humano u otros vertebrados.
Homólogos de Ivy ortólogos vs. parálogos.
La mayoría de los miembros identificados de la familia de proteínas Ivy, incluyendo los homólogos más cercanos a E. coli Ivy, muestran una conservación absoluta de la subsecuencia CKPHDC (SI Fig. 5a ). Este motivo coincide exactamente con el bucle inhibidor de lisozima identificado en la estructura 3D del complejo HEWL/Ivyc y en nuestros estudios funcionales de los mutantes del bucle Ivyc (véase más arriba). Basándonos en estos datos, clasificamos los homólogos de Ivy que presentan esta secuencia de bucle como ortólogos de buena fe del gen Ivy de E. coli (es decir, que se predice que son inhibidores de la lisozima y realizan la misma función en sus respectivas especies). Otras dos secuencias ortólogas contienen una conservación casi exacta del bucle, con la sustitución del residuo de aspartato por un residuo de asparagina en la secuencia Ivy de Burkordelia cepacia (48% de identidad con Ivyc) y la sustitución del residuo de lisina por un residuo de arginina en la secuencia Ivy de Gluconobacter oxydans 621H (26% de identidad con Ivyc). Los análisis de estas mutaciones en el contexto de la estructura 3D del complejo Ivyc/HEWL sugieren que ambas deberían ser compatibles con una adecuada interacción lisozima/Ivy y, por tanto, con la inhibición de la lisozima. Los cinco homólogos de Ivy restantes que presentan secuencias de bucle no canónicas se denominaron entonces paralogos de Ivy de E. coli (es decir, se predijo que realizarían funciones diferentes) (SI Fig. 5b ). Los paralogos Ivy sólo se encuentran en especies del género Pseudomonas: P. aeruginosa, P. syringae, P. putida y P. fluorescens, todas ellas con secuencias de bucle CExxDxC relacionadas, pero diferentes. Además, P. aeruginosa es la única especie que presenta una versión ortóloga y otra paralógica de Ivy. La secuencia ortóloga de Ivy de P. aeruginosa es también la más similar a la secuencia paralógica de Ivy de P. aeruginosa, lo que sugiere fuertemente que una duplicación genética que conduce al bucle no canónico en los paralogos de Ivy se produjo a lo largo de la rama que conduce a las Pseudomonadáceas. La ausencia de homólogos de Ivy en el cercano género Acinetobacter podría estar causada por pérdidas genéticas posteriores.
Expresión y caracterización funcional de los homólogos de Ivy de P. aeruginosa.
Para probar nuestras predicciones funcionales sobre las formas ortólogas frente a las paralógicas de Ivy, expresamos (ver Materiales y Métodos) el producto de ambos genes relacionados con Ivy de P. aeruginosa. Las dos proteínas denominadas Ivyp1 (ortóloga) e Ivyp2 (paralógica) se purificaron y se comprobó su actividad inhibidora frente a HEWL. Como se predijo a partir de sus respectivas secuencias de bucle, se comprobó que la proteína Ivyp1 (CKPHDC) inhibía la actividad de la lisozima, mientras que la Ivyp2 (CEKSDC) no lo hacía. El resultado de la inhibición de Ivyp1 de la actividad de HEWL se presenta en la SI Fig. 7a . En cuanto a Ivyc, la inhibición sigue un mecanismo de «unión lenta y estrecha» con un Kiapp {Ivyp1, HEWL} de ≈25 nM.
Estructura de P. aeruginosa Ivyp1 (Código PDB 1UUZ).
Después de la demostración de que P. aeruginosa Ivyp1 y E. coli Ivy mostraban actividades antilisocimas similares, determinamos la estructura del complejo Ivyp1:HEWL para visualizar cómo se conservaba la interacción inhibidora a pesar de la remota similitud de estas dos secuencias proteicas de Ivy (30% de residuos idénticos; SI Fig. 5a ). Como se esperaba, la estructura de Ivyp1 es similar a la estructura del monómero de Ivyc. Sin embargo, como se predijo a partir de la no conservación de los residuos implicados en la formación de dímeros de Ivyc, P. aeruginosa Ivyp1 es un monómero.
A pesar de esta diferencia significativa, la interacción de los dos homólogos de Ivy con la molécula de lisozima es notablemente similar (Fig. 2, SI Fig. 7b , y SI Tabla 4). La Cα rmsd entre los monómeros Ivyp1 e Ivyc es ≈2,8 Å. A continuación, comparamos las superficies de interacción en los dos complejos para identificar los residuos clave responsables de la solidez de la interacción Ivy-lisozima. En ambos complejos de Ivy, la interacción Ivy-HEWL implica la misma cantidad de puentes salinos, enlaces de hidrógeno que implican cadenas laterales, cadenas laterales/cadenas principales e interacciones de cadena principal. Sin embargo, entre los numerosos residuos implicados en la interacción con la lisozima, sólo tres están estrictamente conservados el residuo de histidina (H60 en Ivyc, H62 en Ivyp1) que forma tanto un enlace de hidrógeno directo (E35-OE1) como un enlace de hidrógeno indirecto a través de una molécula de agua (D52-OD1) dentro del sitio activo de HEWL, un residuo de aspartato (D61 en Ivyc y D63 en Ivyp1), y un residuo de glutamato (E120 en Ivyc y E123 en Ivyp1). A continuación, comparamos las áreas de interacción en los dos complejos. Debido al estado dimérico de la molécula de Ivyc, la superficie enterrada al formarse el complejo Ivyc-HEWL es mayor (≈1.340 Å2) que la del complejo Ivyp-HEWL (≈1.000 Å2). Esta diferencia explica probablemente la menor actividad inhibitoria (25 veces menos) de Ivyp1 en comparación con Ivyc.