RESULTADOS
Estudios de inhalación de 21 días en los que se comparó el humo de la corriente principal y el de la corriente lateral
El primer estudio del humo de la corriente lateral en el INBIFO, el estudio 3047,13-16 fue un estudio de inhalación de 21 días iniciado en noviembre de 1981. Se expusieron ratas macho Sprague Dawley a concentraciones iguales (basadas en el total de partículas (TPM) por litro) de humo de cigarrillo convencional, de humo de corriente lateral de un cigarrillo que se fumaba según el protocolo de la Comisión Federal de Comercio (FTC),17 y de humo de corriente lateral de un cigarrillo de combustión libre.14 Dado que las partículas de humo de cigarrillo fresco de corriente lateral tienen un diámetro aerodinámico medio de masa de 0,23 μM,18 las mediciones modernas de partículas de PM2,5 y PM3,5 son equivalentes a las mediciones de TPM utilizadas por INBIFO.
La concentración de humo fue de 170 μg/l de TPM (170 000 μg/m3), aproximadamente un tercio de la dosis máxima tolerada determinada por los estudios de inhalación anteriores de INBIFO sobre el humo de corriente principal.19,20 Veinte ratas de cada grupo de exposición fueron expuestas al humo siete horas al día durante 21 días. El método de exposición fue «sólo cabeza», lo que significa que las ratas fueron colocadas con la cabeza por delante en tubos de plástico ajustados con una parte de la cabeza apantallada que se proyectaba en un conducto por el que fluía el aire ahumado. Los controles del experimento consistieron en ratas que se mantuvieron en sus jaulas normales (controles de jaula) y ratas que se colocaron en tubos de exposición pero a las que se les dio aire fresco para respirar (exposición simulada).
Ninguna de las ratas de control murió, una rata del grupo de exposición de corriente principal murió, 11 ratas del grupo de corriente lateral soplada murieron o se mataron en estado moribundo, y 12 ratas del grupo de corriente lateral de combustión libre murieron o se mataron en estado moribundo14 (tabla 1). Al final de las exposiciones diarias, la temperatura corporal media era de 37°C para las ratas expuestas al simulacro y a la jaula de control, de 36°C para las ratas expuestas a la corriente principal y de 32°C para las ratas expuestas a la corriente lateral14 (tabla 1). El aumento de la mortalidad indica que el humo de la corriente lateral fue más tóxico de forma aguda y el descenso de la temperatura corporal sugiere un shock y una función metabólica deprimida en las ratas expuestas a la corriente lateral21.
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Estudios de inhalación de humo durante 21 días en ratas: concentraciones altas
La frecuencia respiratoria de los grupos de control simulado y de jaula fue de 107 respiraciones/min, la de las ratas expuestas a la corriente principal de 91 respiraciones/min, y la de las expuestas a la corriente lateral de 86 respiraciones/min.14 Las ratas simuladas y las de control en jaula aumentaron de peso durante los 21 días de exposición hasta alcanzar aproximadamente el 150% de su peso corporal inicial; el grupo expuesto a la corriente principal alcanzó el 130% de su peso corporal inicial; los grupos expuestos a la corriente lateral perdieron peso, cayendo hasta el 80% de su peso corporal inicial14 (tabla 1). La disminución de los pesos corporales se asoció con la disminución del consumo de alimentos y sugiere shock y caquexia.21
Después de 21 días de exposición, el 6% de las ratas expuestas a la corriente principal mostraron una ligera atrofia del epitelio olfativo, y el 13% mostraron una ligera hiperplasia de las células basales del epitelio ciliado en la cavidad nasal. Todas las ratas expuestas a la corriente lateral mostraron una atrofia o ulceración pronunciada del epitelio olfativo y tanto hiperplasia como metaplasia de células escamosas del epitelio ciliar en la cavidad nasal, con cornificación en algunos casos (tabla 1). Los investigadores concluyeron: «La exposición a la corriente lateral indujo lesiones epiteliales más frecuentes y más graves en el epitelio olfativo y ciliado de la cavidad nasal que la corriente principal. Si se extrapola la experiencia de los estudios de inhalación anteriores de la corriente principal, la concentración total de material particular de este estudio tendría que multiplicarse por tres para producir reacciones fuertes similares a las observadas con la exposición a la corriente lateral en este estudio».14
En total se realizaron siete estudios de inhalación de 21 días en los que se comparó el humo de la corriente principal con el de la corriente lateral entre 1982 y 1985 (3057,35-37 3061,20,22-24 3069,25-29 3081,30-33 3108,38 311339,40). Cuatro de estos estudios (3057, 3061, 3069, 3081) utilizaron concentraciones de humo suficientes para matar al 10% o más de las ratas (tabla 1). La pérdida de peso y la temperatura rectal inferior a 33,5°C se correlacionaron con la mortalidad. Promediando los cuatro estudios, el humo de la corriente lateral causó tasas similares de mortalidad a un tercio de la concentración (140 μg/l de TPM) del humo de la corriente principal (469 μg/l).
Los técnicos que manipularon los animales también observaron otros signos, más sutiles, de la toxicidad comparativa del humo de los cigarrillos de la corriente lateral. El estudio 3061 comparó una dosis de 380 μg/l de TPM en la corriente principal con una dosis de 90 μg/l en la corriente lateral. Los responsables de los animales observaron: «todas las ratas tratadas con humo mostraron signos generales de agotamiento tras el final de la exposición diaria. Al contrario que todas las demás ratas, que se recuperaron hasta la mañana siguiente, las ratas del grupo de corriente lateral más alta siguieron mostrando un pelaje desgreñado y una temperatura rectal ligeramente disminuida».24 Teniendo en cuenta todos estos factores, los autores de los informes integradores de los estudios 3069 y 3081 afirmaron «Los grupos expuestos a la corriente principal y a la dosis alta de corriente lateral reaccionaron de forma aproximadamente similar, aunque la concentración de TPM en el grupo expuesto a la corriente lateral de dosis alta fue aproximadamente un factor de cuatro menor que en el expuesto a la corriente principal».25,41
Los resultados del examen histopatológico de los epitelios respiratorios apoyan la idea de que el humo de la corriente lateral es cuatro veces más tóxico que el humo de la corriente principal por gramo. En comparación con el TPM, la concentración de humo de la corriente lateral suficiente para provocar la necrosis del epitelio que recubre la cavidad nasal fue del 23% de la de la corriente principal (tabla 1). La concentración de humo de la corriente lateral suficiente para causar atrofia del epitelio olfativo era una décima parte de la de la corriente principal y la concentración de la corriente lateral suficiente para causar metaplasia escamosa del epitelio nasal era una tercera parte (tabla 1).
En marzo de 1982, los investigadores del INBIFO compararon los condensados de humo de la corriente principal y de la corriente lateral (recogidos en una trampa de impactación) en una prueba de mutagénesis bacteriana (306742). Utilizaron el ensayo de incorporación en placa con microsomas S9 y dos cepas de Salmonella typhimurium, la TA 98 (que detecta mutaciones de desplazamiento de cuadro) y la TA 100 (que detecta la sustitución de pares de bases de ADN). La cepa TA 98 no mostró ninguna diferencia, pero la cepa TA 100 mostró una actividad un 30% mayor con el condensado de flujo lateral. Estos resultados sugieren que el condensado de la corriente lateral y sus productos de descomposición metabólica indujeron más sustituciones de pares de bases por gramo que el condensado de la corriente principal.
Tumorigénesis
En 1982, el condensado del humo de la corriente lateral se incluyó en un experimento de 80 semanas de tumorigénesis por pintura de la piel en ratones (306843-45). La mitad de los ratones recibió un único tratamiento previo con 7,12 dimetilbenz(α)antraceno (DMBA), y la otra mitad no. Los compuestos químicos como el DMBA, que son suficientes para causar tumores por sí mismos, se denominan iniciadores de tumores. Los compuestos químicos que no causan tumores por sí mismos, pero que aumentan la incidencia o la multiplicidad de los tumores cuando se aplican después de un iniciador de tumores, se denominan promotores de tumores. Las dosis de condensado de humo de cigarrillo aplicadas fueron de 60, 90 o 120 mg por ratón y semana.
Los signos de intoxicación (actividad frenética, posición prona, jadeo, ojos cerrados) fueron más pronunciados entre los ratones tratados con sidestream y persistieron durante más tiempo. Sólo el condensado de sidestream causó una mortalidad dependiente de la dosis45 (tabla 2). Entre los ratones que no fueron tratados con DMBA, la incidencia de tumores fue 3,4-5 veces mayor en los ratones tratados con condensado de flujo lateral que en los ratones tratados con condensado de corriente principal (tabla 2), lo que sugiere que el condensado de flujo lateral es un iniciador de tumores mucho más potente que el condensado de corriente principal. Teniendo en cuenta el tiempo de desarrollo de los tumores, la incidencia de los mismos y su multiplicidad, los investigadores del INBIFO concluyeron que el condensado de corriente lateral, sin tratamiento con DMBA, era de 2 a 6 veces más tumorígeno que el condensado de corriente principal y que el condensado de corriente lateral, precedido de un tratamiento con DMBA, era de 2 a 3 veces más tumorígeno que el condensado de corriente principal43.
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Tumorigenicidad cutánea del condensado de humo completo de la corriente principal y de la corriente lateral43-45
Toxicidad aguda
El primer estudio de toxicidad aguda (307146,47) comparó aplicaciones únicas de condensado de humo de cigarrillo de la corriente principal y de la corriente lateral, de entre 100 y 2115 mg/kg de peso corporal, en ratones.48 Los ratones fueron estudiados durante dos semanas después de la aplicación del condensado. La concentración LD50 (concentración suficiente para causar la muerte del 50% de los animales) para el condensado de corriente lateral fue de 608 mg/kg. Los animales pintados con condensado de corriente principal no alcanzaron el 50% de mortalidad durante el estudio, pero la DL50 extrapolada fue de 2370 mg/kg. La DL50 de la corriente lateral para la exposición dérmica fue aproximadamente un tercio de la DL50 de la corriente principal.
El estudio 3099,47 una prueba de toxicidad en células de cultivo de tejido pulmonar humano, también demostró la diferencia de toxicidad entre el humo de la corriente principal y el de la corriente lateral. Las células se sembraron en monocapas confluentes, se dejaron adherir durante la noche y se expusieron al humo fresco.49 El humo se bombeó al espacio de aire sellado por encima de las células pulmonares y el medio de cultivo en concentraciones variables y se mantuvo durante la noche, luego las células se separaron de los frascos y se comprobó su viabilidad a la mañana siguiente. La DL50 para el humo de la corriente lateral era un tercio de la del humo de la corriente principal.49
En 1984, la investigación sobre el humo de la corriente lateral comenzó a pasar de los efectos toxicológicos agudos y la tumorigénesis a la comprobación de sus efectos en tipos de células y sistemas celulares específicos, en un esfuerzo por determinar qué componentes químicos hacían que el humo de la corriente lateral fuera especialmente irritante, y por encontrar un nivel sin efecto observable (NOEL) para la inhalación del humo de la corriente lateral.
Células blancas
Tres estudios probaron el efecto de la inhalación de humo en las poblaciones de células blancas dentro del pulmón (3108,38 3113,39,40 501550). La inhalación de humo de la corriente principal y de la corriente lateral no tuvo efectos tan notablemente diferentes en estas células como en el epitelio respiratorio. Ambos tipos de humo aumentaron el número de leucocitos polimorfonucleares y macrófagos alveolares pulmonares recuperados de los pulmones,38 pero disminuyeron el número de leucocitos totales recuperados de la sangre.39 Los linfocitos recuperados de los pulmones de los animales expuestos a la corriente principal tenían tasas ligeramente superiores de proliferación inducida por mitógenos que los de los animales expuestos a la corriente lateral.50 Los linfocitos recuperados de los animales expuestos a la corriente lateral eran menos viables que los de los animales expuestos a la corriente principal.38,50 Los resultados de la reducción de la viabilidad de los linfocitos sugieren que la capacidad inmunitaria de los animales expuestos al humo de la corriente lateral podría estar reducida en relación con la de los animales expuestos al humo de la corriente principal.51
Base química de la mayor toxicidad de la corriente lateral
El primer estudio que examinó la base química de la diferencia entre el humo de la corriente principal y el de la corriente lateral comparó el humo de la corriente lateral y el vapor de amoníaco en un experimento de inhalación de un día con ratas (310452-54). El humo de la corriente lateral contiene entre 15 y 300 veces más amoníaco que el humo de la corriente principal. En la introducción del informe 3104 se afirma que «se esperaba que el amoníaco fuera uno de los principales complementos irritantes del humo de la corriente lateral».52 Se probaron cinco concentraciones de humo de la corriente lateral, que oscilaban entre 13 y 253 μg/l de TPM. Las cinco concentraciones de vapor de amoníaco probadas oscilaban entre 51 μg/l (aproximadamente el amoníaco de 253 μg/l de flujo lateral de TPM) y 414 μg/l (aproximadamente 10× el amoníaco de 253 μg/l de flujo lateral de TPM).
Doce de las 20 ratas expuestas a la mayor concentración de flujo lateral murieron. Ninguna de las ratas de los grupos con amoníaco murió.52 En promedio, durante las siete horas, la frecuencia respiratoria de las ratas del grupo con la dosis más alta de corriente lateral fue menos de la mitad de la de los controles simulados. La frecuencia respiratoria de las ratas del grupo con la dosis más alta de amoníaco fue igual a la de los controles simulados.52 En las concentraciones más altas de flujo lateral, la temperatura corporal de las ratas descendió de forma constante durante las siete horas de exposición, de 37°C a 30°C, pero la temperatura de los grupos con amoníaco no cambió. Los científicos del INBIFO concluyeron que el humo de la corriente lateral es 10 veces más irritante que el vapor de amoníaco que contiene.52
El estudio 506155 fue una continuación del estudio 3104. Probó los efectos de cinco sustancias químicas que se encuentran en altas concentraciones en el humo de la corriente lateral -formaldehído, acetaldehído, acroleína, amoníaco e isopreno- en una exposición de tres días en la que se midió la cantidad de dióxido de carbono exhalado por las ratas.55 Los cambios en la cantidad de dióxido de carbono exhalado indican cambios tanto en la frecuencia respiratoria como en el volumen corriente. La disminución de la frecuencia respiratoria y la respiración superficial son respuestas a la irritación sensorial.56 El estudio descubrió que la combinación de los cinco compuestos, en las concentraciones en las que están presentes en el humo de la corriente lateral, era sólo un 10-20% tan irritante como el humo de la corriente lateral completa.55
El siguiente estudio (312457-61) para examinar la base química de la toxicidad del humo de la corriente lateral comparó los efectos del humo de la corriente lateral completa, la fase de partículas del humo de la corriente lateral, la fase de gas y vapor del humo de la corriente lateral, y una corriente lateral recombinada hecha de la fase de partículas y la fase de gas y vapor. Las ratas fueron expuestas a los diferentes humos durante siete horas al día durante tres días. Se controló la respiración, los síntomas de irritación, la temperatura corporal y el peso corporal, y luego se mató a las ratas y se examinaron sus vías respiratorias.
El humo de la corriente lateral completa fue el más irritante, seguido de la fase de gas/vapor, la fase de humo recombinado y, por último, la fase de partículas.58 La fase de gas/vapor tuvo efectos mucho más fuertes en el epitelio que recubre el tracto respiratorio que la fase de partículas.60 La incidencia de hiperplasia y metaplasia fue mayor entre los animales expuestos a la fase de gas/vapor que entre los animales expuestos a la fase de partículas.60 El único lugar del tracto respiratorio en el que la fase de partículas causó más daño que la fase de gas/vapor fue la laringe anterior,60 posiblemente porque la laringe anterior es un lugar importante de impacto de las partículas inhaladas en la rata.62
El experimento 506263 comparó los efectos en el epitelio respiratorio superior del humo de la corriente lateral completa, de la fase de gas/vapor de la corriente lateral y de una mezcla de formaldehído, acroleína y amoníaco al doble de la concentración a la que estos compuestos están presentes en el humo de la corriente lateral completa. La mezcla causó aproximadamente el 35% del daño causado por el humo de la corriente lateral completa.63
El experimento 312664-66 comparó el humo de la corriente lateral de los cigarrillos 2R1 con la corriente lateral de un cigarrillo sin tabaco, la corriente lateral del cigarrillo sin tabaco con nicotina añadida y los aerosoles de nicotina pura, formaldehído, acetaldehído, acroleína y amoníaco. Las concentraciones de los aerosoles de sustancias químicas individuales se escalaron de manera que la concentración más alta fuera aproximadamente el doble de la concentración de ese componente en el humo de 2R1.
Los puntos finales evaluados incluyeron el aumento de peso, la exhalación de dióxido de carbono (CO2) y la histopatología del tracto respiratorio. El humo de 2R1 fue el que más redujo el aumento de peso, seguido del cigarrillo sin tabaco con nicotina añadida, el cigarrillo sin tabaco y, a continuación, la nicotina pura y la acroleína.66 El humo de 2R1 y la nicotina, en sus concentraciones más altas, redujeron la temperatura corporal en 5°C y 3,5°C, respectivamente.66 Las concentraciones media y máxima del humo de 2R1 disminuyeron la exhalación de CO2 en aproximadamente un 50%.66 La concentración más alta de nicotina pura disminuyó la exhalación de CO2 en aproximadamente un 20%.66 El aerosol de acroleína tuvo un 20-25% del efecto del humo de 2R1 en la histopatología del epitelio respiratorio.64 En la laringe, la concentración más alta de aerosol de acroleína causó casi tanto engrosamiento del epitelio como el humo de 2R1.64 El formaldehído, el acetaldehído y el amoníaco no tuvieron efectos. En conjunto, estos experimentos muestran que, aunque la acroleína y la nicotina pueden explicar algunos de los efectos del humo de la corriente lateral, el humo completo es más tóxico que la suma de los efectos de sus componentes principales.
Niveles de efecto no observables
En 1985 se inició una serie de experimentos diseñados para comparar diferentes métodos de exposición y encontrar el NOEL para la exposición a corto plazo (21-90 días) del humo fresco de la corriente lateral utilizando concentraciones de 2-20 μg/l de TPM y tres métodos diferentes de exposición al humo. El método utilizado en el estudio 311467,68 fue sólo de cabeza, el método estándar utilizado en todos los experimentos anteriores. Los estudios 312569 y 312770 utilizaron una exposición sólo en la nariz. Este método requería una cámara de exposición más restrictiva y provocaba un mayor estrés en los animales. Las ratas expuestas de forma simulada, confinadas en tubos de exposición de sólo nariz y con aire fresco para respirar, pesaron un 20% menos que las ratas de control en jaula. El estudio 312334,71-73 utilizó una exposición de cuerpo entero. En el sistema de exposición de cuerpo entero, los animales fueron expuestos al humo mientras estaban en sus jaulas, moviéndose libremente en grupos de dos, en lugar de estar confinados solo en un tubo de exposición.
El estudio 311467,68 probó el humo de corriente lateral a 3, 5 y 17 μg/l de TPM. Las ratas se dividieron en dos grupos, uno que recibió el humo durante 3,5 horas/día y el otro durante 7 horas/día. También probaron los efectos de un periodo de recuperación de 14 días tras la exposición al humo. Basándose en los resultados, los científicos del INBIFO propusieron diferentes NOEL para cada lugar del tracto respiratorio superior: 2 μg/l para la hiperplasia de las células de reserva del epitelio de la parte delantera de la nariz, 17 μg/l para la cornificación del epitelio de la parte delantera de la nariz y la atrofia del epitelio olfativo, y entre 2-17 μg/l para la hiperplasia del epitelio de las cuerdas vocales, dependiendo del lugar exacto dentro de las cuerdas vocales (tabla 3). (Estos niveles no son verdaderos NOEL, ya que todavía se observaron algunos efectos). Todos los cambios observados en el epitelio respiratorio causados por 21 días de inhalación fueron reversibles tras 14 días de recuperación.
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Estudios de inhalación de humo durante 21 días: concentraciones bajas
El estudio 312334,71-73 midió los efectos de concentraciones más elevadas de humo de corriente lateral (20 y 60 μg/l de TPM) utilizando un sistema de exposición de cuerpo entero. Los técnicos responsables de mantener la concentración de humo en los niveles especificados tomaron muestras del humo justo antes de que se liberara en las jaulas y desde el interior de las mismas y observaron que: «Las concentraciones ‘reales’ en las jaulas eran inferiores a las determinadas en la entrada por el factor 0,8-0,9 para el TPM, 0,6 a 0,8 para la nicotina, 0,3 para el amoníaco y 0,4 a 0,5 para el formaldehído. Las concentraciones más bajas de algunos componentes del humo se reflejaron en daños menos graves en el tracto respiratorio.72 A pesar de las bajas concentraciones de humo y de las cámaras de exposición no restrictivas, las ratas expuestas al humo siguieron mostrando una disminución en el aumento de peso de aproximadamente el 15%71 (tabla 3).
Los estudios 312569 (21 días) y 312770 (90 días) probaron 2 μg/l y 6 μg/l de TPM utilizando sólo la exposición nasal. En la exposición de 21 días ninguna de las dos concentraciones causó hiperplasia en el epitelio nasal y la concentración de 6 μg/l causó hiperplasia y una ligera metaplasia en las cuerdas vocales (tabla 3), así como una disminución en el aumento de peso del 12% para el grupo de baja concentración y del 24% para el de alta concentración.74 En el estudio de 90 días ambas dosis causaron hiperplasia en el epitelio nasal y en las cuerdas vocales70 (tabla 4), pero no hubo ningún efecto en el aumento de peso. Con 6 μg/l de TPM durante 90 días se produjo una metaplasia significativa en las cuerdas vocales. El daño al epitelio respiratorio en ambas concentraciones fue más grave y más prevalente después de 90 días que después de 21 días70 (tabla 4), lo que demuestra que las exposiciones más prolongadas al humo de la corriente lateral causan un daño más grave en el tracto respiratorio.
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Estudios de inhalación de 21 días frente a 90 días