La clonación de ADN puede ser realizada espontáneamente por la célula con fines reproductivos. Se trata de una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en fragmentos y luego cada uno de estos fragmentos se convierte en individuos maduros y completamente desarrollados que son clones del organismo original (Ver fragmentación reproductiva).La clonación de ADN también puede ser realizada intencionalmente por investigadores de laboratorio. En este caso, la fragmentación del ADN es una técnica de genética molecular que permite a los investigadores utilizar la tecnología del ADN recombinante para preparar un gran número de moléculas de ADN idénticas.Para que la clonación del ADN se complete, es necesario obtener regiones discretas y pequeñas del ADN de un organismo que constituyan genes específicos. Sólo se pueden clonar moléculas de ADN relativamente pequeñas en cualquier vector disponible. Por lo tanto, las largas moléculas de ADN que componen el genoma de un organismo deben dividirse en fragmentos que puedan insertarse en el ADN del vector. Dos enzimas facilitan la producción de tales moléculas de ADN recombinante:
1. Enzimas de restricciónLas enzimas de restricción son endonucleasas producidas por las bacterias que suelen reconocer pequeñas secuencias de pares de bases (llamadas sitios de restricción) y luego escinden ambas cadenas de ADN en este sitio. Un sitio de restricción suele ser una secuencia palindrómica, lo que significa que la secuencia del sitio de restricción es la misma en cada hebra de ADN cuando se lee en la dirección 5′ a 3′.Para cada enzima de restricción, las bacterias también producen una enzima de modificación para que el propio ADN de la bacteria huésped esté protegido de la escisión. Esto se consigue modificando el ADN del huésped en cada sitio potencial de escisión o cerca de él. La enzima de modificación añade un grupo metilo a una o dos bases, y la presencia de este grupo metilo impide que la endonucleasa de restricción corte el ADN.
Muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera fragmentos con una «cola» de una sola hebra que sobresale en ambos extremos, llamada extremo romo. Las enzimas de restricción también pueden hacer cortes rectos en las dos cadenas de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera extremos romos. 2. Durante la replicación normal del ADN, la ADN ligasa cataliza la unión de extremo a extremo (ligadura) de fragmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki. Para los fines de la clonación del ADN, la ADN ligasa purificada se utiliza para unir covalentemente los extremos de un fragmento de restricción y el ADN del vector que tienen extremos complementarios. La ADN ligasa puede ligar extremos complementarios pegajosos y romos, pero la ligación de los extremos romos es ineficaz y requiere una mayor concentración de ADN y de ADN ligasa que la ligadura de los extremos pegajosos. Por esta razón, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en la clonación de ADN realizan cortes escalonados en las cadenas de ADN para crear extremos pegajosos.
La clave para clonar un fragmento de ADN es unirlo a una molécula de ADN vectorial que pueda replicarse dentro de una célula huésped. Después de introducir una única molécula de ADN recombinante (compuesta por un vector más un fragmento de ADN insertado) en una célula huésped, el ADN insertado puede replicarse junto con el vector, generando un gran número de moléculas de ADN idénticas.El esquema básico para ello puede resumirse de la siguiente manera:
Vector + Fragmento de ADN↓ ADN recombinante↓ Replicación del ADN recombinante dentro de la célula huésped↓ Aislamiento, secuenciación y manipulación del fragmento de ADN purificado
Existen numerosas variaciones experimentales de este esquema, pero estos pasos son esenciales para la clonación de ADN en un laboratorio.