Un microscopio confocal es un tipo de microscopio de fluorescencia 3D en el que se aumenta la resolución rechazando la luz desenfocada. Esto se hace mediante el uso de agujeros de alfiler con un radio de agujero de alfiler específico y hace que sea un microscopio 3D intrínseco: debido a la naturaleza de enfoque del microscopio confocal, es especialmente adecuado para obtener imágenes 3D como una colección de intensidades en diferentes puntos del espacio.
Las imágenes confocales son muy adecuadas para la deconvolución de Huygens, con la opción óptica confocal de Huygens, debido a dos razones principales:
1. Siguen sufriendo de desenfoque, lo que se aprecia claramente cuando se registran imágenes de perlas
2. en general, las imágenes confocales son más ruidosas que las de campo amplio, porque la luz del objeto es rechazada por el agujero de alfiler.
En los microscopios confocales, la tasa de Nyquist es aproximadamente la mitad de la de los microscopios de campo amplio.
Cómo funciona un microscopio confocal
Los sistemas biológicos son típicamente estructuras tridimensionales. Cuando la muestra marcada con fluoróforos se inunda con luz láser de excitación como en la microscopía de campo amplio convencional, la imagen resultante suele estar muy perturbada por la luz fluorescente desenfocada. Esto hace que la imagen se vea borrosa y que el contraste disminuya considerablemente. La microscopía confocal es una técnica para reducir esta luz desenfocada no deseada. En esta técnica, la luz de excitación se enfoca fuertemente en la muestra. La luz de emisión del foco es recogida por el mismo objetivo, tras lo cual se enfoca a través de un pequeño agujero de alfiler y se dirige hacia un fotodetector (Figura 1 (a)). La luz de emisión desenfocada será bloqueada en gran medida por el agujero de alfiler (Figura 1 (b)). El resultado de este método es que sólo la luz del volumen focal puede llegar al detector. El inconveniente es que también se bloquea la luz de otros lugares del plano focal: la microscopía confocal es una excitación puntual y una detección puntual. Una solución es escanear la muestra punto por punto para reconstruir una imagen completa en la que sólo se recoge la señal fluorescente del plano focal. Este escaneo de trama puede repetirse para diferentes planos focales para seccionar muestras gruesas y reconstruir una imagen 3D de la muestra.
Alternativamente, también es posible escanear la muestra con múltiples puntos de excitación en paralelo, como con un microscopio de disco giratorio.
STED es prácticamente una extensión de la microscopía confocal de escaneo puntual. El haz STED debe enfocarse en la muestra para obtener la alta intensidad necesaria para la emisión estimulada, mientras que la detección puntual reduce la luz desenfocada. Para que la STED funcione, el centro del foco de excitación y el nulo de intensidad de la STED del foco en forma de rosquilla deben solaparse perfectamente. A continuación, se puede obtener una imagen mediante el escaneo de la muestra, por ejemplo, con una etapa de escaneo piezoeléctrica. El tamaño del agujero de alfiler utilizado determinará la profundidad de enfoque del microscopio.
Deconvolución de imágenes confocales
Aplicando la deconvolución a las imágenes confocales se aumenta su resolución en x, y y z y se restaura del ruido. Por lo tanto, las imágenes serán más fáciles de visualizar y analizar. El algoritmo por defecto para Confocal es Classic Maximum Likelihood Estimation (CMLE) y el valor por defecto de SNR es 20. Sugerimos comenzar con los parámetros por defecto y explorar otros valores de SNR, por ejemplo, para optimizar los resultados de deconvolución. No debe pensar en la SNR como un parámetro que describe la imagen original, sino como un parámetro ajustable que controla el resultado de la deconvolución. Utilizar un valor de SNR demasiado grande puede ser arriesgado cuando se restauran originales ruidosos, porque podría estar aumentando el ruido. Una imagen confocal ruidosa puede tener valores de SNR inferiores a 20. Otra opción es probar el algoritmo de Estimación de Máxima Verosimilitud del Bien (GMLE) para mejorar los resultados. El GMLE es adecuado para imágenes ruidosas, como confocal o STED.
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Remko R.M. Dijkstra, Design and realization of a CW-STED super-resolution microscope setup, Master Thesis , University of Twente, 2012