2.1. Propiedades de crecimiento de S. boulardii
Para caracterizar aún más esta levadura, se comparan sus propiedades de crecimiento a diferentes temperaturas con otras cepas de levadura diploide (todas las cepas de levadura utilizadas se resumen en la Tabla 1). S. boulardii (mantendré este nombre en el texto aunque sea una cepa de S. cerevisiae) crece bien en medio rico a 30°C así como a 37°C pero no a 40°C (Figura 1A). El crecimiento a 37°C -aunque no es ideal- no es extraño para las cepas de levadura como la cepa diploide BY4743 (un derivado de S288C), pero a diferencia de la cepa diploide RH2585/2586 (un derivado de Σ1278b) que apenas crece a 37°C (Figura 1A). En este sentido, el crecimiento a 37°C no es una propiedad particular y única de S. boulardii. Probablemente refleja más bien su acomodación a climas cálidos como los que se encuentran a menudo en Indochina.
| Nombre y propiedades de la cepa de levadura diploide | Propiedadesuxotróficas propiedades/resistencias a los antibióticos |
|---|---|
| BY4743 | Requiere histidina, leucina, metionina y uracilo |
| RH2585/2586 | Requiere histidina y uracilo |
| RH2585/2586 ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR | Sin requisitos; resistente a G418- y NAT |
| S. boulardii | Ninguna | S. boulardii ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR | Sin requisitos; resistente a G418 y NAT |
| S. boulardii ∆rem1::kanX ∆rem1::NATR | Sin requisitos; resistente a G418 y a NAT | S. boulardii ∆his3::kanX ∆his3::NATR | Requiere histidina; resistente a G418 y a NAT | S. boulardii ∆ade2::kanX ∆ade2::NATR | Requiere adenina; G418- y resistente a NAT |
Cruzas de levadura diploide utilizadas en este trabajo.
G418/geneticina y NAT/neotiricina son antibióticos selectivos para las cepas de levadura.
Figura 1.
Propiedades de S. boulardii y otras cepas de levadura diploide (todas ellas listadas en la Tabla 1). (A) Comparación del crecimiento de las cepas de levadura a diferentes temperaturas. Las cepas de levadura indicadas se extendieron en placas YPD y se incubaron a las temperaturas indicadas (30, 37 y 40°C) durante 2 días; (B) propiedades de filamentación de diferentes cepas de levadura. Las cepas RH2585/2586, RH2585/2586 ∆flo8::kanX ∆flo8::NATR, y S. boulardii se incubaron en placas SLAD (50 μM de sulfato de amonio) durante 1 día a 30°C y la colonia de crecimiento individual se visualizó al microscopio (panel superior: aumento de 20×; panel inferior: aumento de 100×); (C) crecimiento de S. boulardii en diferentes medios. S. boulardii (#1785) y los derivados ∆∆his3 (#1811) y ∆∆ade2 (#1812) se cultivaron durante 2 días a 30°C en medio SD mínimo (placa izquierda) o en YPD + G418 y nourseothricin (ambos a 100 μg/ml finales) (placa derecha). Denota el color rosado característico de la cepa #1812 debido a la deleción de ambas copias del gen ADE2.
Una propiedad más investigada es la capacidad potencial de S. boulardii para formar filamentos. Para ello, se cultivó en placas SLAD que sólo llevan concentraciones limitantes de sulfato de amonio (50 μM, aproximadamente 1000× menos que el medio mínimo SD convencional). Como se observó al microscopio, la cepa diploide RH2585/2586 muestra claramente propiedades filamentosas en esas condiciones limitantes de amonio (Figura 1B) . La supresión del gen FLO8, que codifica un factor transcripcional necesario para la filamentación y la adhesión, abolió por completo sus propiedades filamentosas. Flo8 es necesario para expresar, por ejemplo, Flo11, una glicoproteína de la superficie celular. A diferencia de RH2585/2586, S. boulardii apenas mostró propiedades de filamentación. Curiosamente, la secuenciación del gen FLO8 amplificado por PCR de S. boulardii indicó que no lleva un codón de parada prematuro (no mostrado) que se encuentra en cepas de levadura no filamentosa como las derivadas de S288C . Por lo tanto, es probable que otros genes ascendentes o descendentes necesarios para la filamentación sean disfuncionales en S. boulardii. Su falta de filamentación explica probablemente su baja toxicidad y su falta de capacidad de establecimiento en el tracto gastrointestinal que, de otro modo, podría hacerla más persistente y, por tanto, más problemática para las aplicaciones médicas.
Otro tema interesante fue inducir la meiosis y la esporulación en S. boulardii para obtener una progenie haploide. Para ello, se incubaron células diploides en un medio líquido con nitrógeno limitante y una concentración muy alta de acetato de potasio como fuente de carbono (pobre) . A pesar de varios intentos, no se observó la formación de tétradas. A este respecto, S. boulardii muestra propiedades similares a las de RH2585/2586 (el diploide filamentoso utilizado en este trabajo) que no forma tétradas al ser tratado en las condiciones descritas. Para inducir la meiosis y la esporulación, se produjo un doble knockout de RME1 (Regulador de la Meiosis 1) en S. boulardii. RME1 es un regulador negativo de la meiosis que impide la expresión de proteínas necesarias para la meiosis, como IME1 (Inducer of Meiosis 1), y promueve la mitosis. El derivado S. boulardii ∆∆rme1 no mostró ninguna diferencia fenotípica con la cepa parental de tipo salvaje en cuanto a la temperatura de crecimiento (Figura 1A). Lamentablemente, tampoco se obtuvieron tétradas de esta cepa knockout. Concluyo que S. boulardii no experimenta la meiosis ni la formación de tétradas haploides al menos en las condiciones de laboratorio utilizadas aquí.
Como se muestra en la Figura 1C, S. boulardii no lleva ningún marcador auxotrófico ya que crece bien en medio mínimo (SD) desprovisto de aminoácidos o componentes de ácidos nucleicos como adenina o uracilo. Los genes marcadores auxotróficos pudieron obtenerse fácilmente delecionando los genes ADE2 (biosíntesis de adenina) o HIS3 (biosíntesis de histidina) (Figura 1C). Estas deleciones se obtuvieron introduciendo genes marcadores auxotróficos dominantes que proporcionan resistencia a los antibióticos kanamicina/G418 o nourseothricin. La deleción de una sola copia del gen ADE2 o HIS3 todavía permitía el crecimiento en placas de medio mínimo (no se muestra), lo que indica el claro carácter diploide de esta levadura. Sólo la deleción doble de ambas copias del gen HIS3 o ADE2 (que la hizo resistente tanto a la kanamicina/G418 como a la nourseothricin; Figura 1C) hizo que esta cepa de levadura fuera auxotrófica para la histidina o para la adenina. La nueva auxotrofia de histidina obtenida se utilizó en un experimento posterior para transformarla con plásmidos de levadura que llevaban HIS3 como gen marcador seleccionable (véase el texto posterior).