Todos los carriles: anticuerpo beta Actina – control de carga (ab8227) a una dilución de 1/5000
Carril 1: extracto de células enteras HeLa
Carril 2: Extracto de células de levadura
Carril 3: Lisado de tejido cerebral de ratón
- Ver nuestra lista de lisados de control positivo disponibles, péptidos de bloqueo y proteínas de control positivo.
- Vea los anticuerpos secundarios AbExcel para realizar western blots excepcionales.
- Vea nuestros protocolos en vídeo fáciles de seguir.
Los protocolos son proporcionados por Abcam «TAL CUAL» basados en la experimentación en los laboratorios de Abcam utilizando los reactivos y productos de Abcam; sus resultados al utilizar protocolos fuera de estas condiciones pueden variar.
Transcripción del seminario
El objetivo del western blot es separar las proteínas en un gel según el peso molecular. A continuación, las proteínas se transfieren a una membrana donde pueden detectarse mediante anticuerpos. Las muestras se calientan a 95 grados C durante cinco a 10 minutos en un tampón de muestra que contiene un agente reductor como el beta-mercaptoetanol. Esto da lugar a proteínas linealizadas con una carga negativa proporcional a su tamaño.
Coloque un gel en el tanque de electroforesis y añada en tampón, asegurándose de que la parte superior de los pocillos esté cubierta. El porcentaje de acrilamida del gel que se utiliza depende del peso molecular de la proteína objetivo. Coloque un peso molecular de mercado en el primer carril y luego cargue las muestras en los pozos adyacentes. Todas las muestras que contienen cantidades iguales de proteína. Una vez cargadas todas las muestras, añada tampón de funcionamiento, coloque la tapa en la cubeta de electroforesis. Encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje recomendado por el fabricante de los geles en el tanque de gel. Debería poder ver cómo suben las burbujas por el tanque. Haga funcionar el gel hasta que el frente de la matriz se haya desplazado lo suficiente por el gel.
La siguiente etapa consiste en transferir las proteínas del gel a una membrana. Las membranas suelen ser de nitrocelulosa o PVDF. Saque el gel del depósito y libérelo con cuidado de su caja de plástico. Corte los pozos y el pie del gel y coloque el gel en el tampón de transferencia. Prepare la pila de transferencia intercalando la membrana y el gel entre el papel de filtro y las esponjas. La membrana debe quedar pegada al electrodo positivo y el gel más cerca del electrodo negativo. Utilizar un pequeño rodillo para eliminar cualquier burbuja entre el gel y la membrana. Tapar la caja de transferencia cerrada y sumergirla en un tanque de transferencia que contenga tampón de transferencia. Añada agua a la cámara exterior para mantener el sistema frío y coloque la tapa. Encienda la fuente de alimentación para comenzar la transferencia de proteínas. El tiempo y el voltaje requieren una optimización, así que consulte las instrucciones del fabricante para orientarse.
Ahora que las proteínas han migrado del gel a la membrana de nitrocelulosa, la proteína de interés puede detectarse como anticuerpo. La membrana puede retirarse del casete y el mercado de peso molecular debería ser ahora visible. Si es necesario, la transferencia de las proteínas puede confirmarse tiñendo la membrana con la solución. Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo, es necesario bloquear la membrana. Vierta el tampón de bloqueo sobre la membrana y agite suavemente sobre un balancín. Normalmente, esto se hace con una solución de cinco por ciento de leche o de albúmina de suero bovino, BSA, durante dos horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados. El tiempo y el tipo de tampón de bloqueo deben optimizarse, así que compruebe la ficha técnica del anticuerpo primario que pretende utilizar para obtener más detalles.
Una vez bloqueada la membrana, retire el tampón de bloqueo y añada el anticuerpo primario diluido en la misma solución. Incubar en el balancín como antes. Normalmente, las incubaciones de anticuerpos primarios son de una hora a temperatura ambiente o de una noche a cuatro grados C. La concentración de anticuerpos y el tiempo de incubación deberán optimizarse. Consulte la hoja de datos del anticuerpo para obtener orientación. Vierta el anticuerpo primario y enjuague la membrana dos veces en tampón de lavado. Siga con un lavado de 15 minutos y tres lavados de 10 minutos en un balancín. El tampón de lavado suele ser una solución salina tamponada con Trys, TBS, o una solución salina tamponada con fosfato, PBS, con un 0,1 por ciento de tween 20.
Verter el tampón de lavado e incubar la membrana en el anticuerpo secundario conjugado que ha sido diluido en el tampón de bloqueo. Por lo general, esto se hace durante una hora a temperatura ambiente, pero será necesario optimizar la concentración de anticuerpos y el tiempo de incubación. Retirar el anticuerpo secundario y lavar la membrana ha mostrado anteriormente.
Hay varios sistemas diferentes para la detección. Si los anticuerpos secundarios se conjugan en una enzima, incubar la membrana en el sustrato apropiado antes de la imagen. Si los anticuerpos secundarios son conjugados fluorescentes, entonces se puede pasar directamente a la etapa de obtención de imágenes. La obtención de imágenes puede realizarse con una película de rayos X o con un sistema de obtención de imágenes digitales. Coloque la membrana en una bandeja de imágenes. Coloque la bandeja de imágenes en el sistema de imágenes. Los tiempos de exposición tendrán que ser optimizados para detectar claramente las bandas relacionadas con las proteínas de interés.