Después de su formación en Yale, donde estudió con Earle R. Gister y actuó en varias obras de Shakespeare, Lathan fue aclamada tanto fuera de Broadway como en los escenarios de Los Ángeles. Animada por su padre a hacer de Los Ángeles su base profesional, obtuvo sus primeros papeles en televisión en episodios de programas como In the House, Family Matters, NYPD Blue y Moesha.
En 1998, Lathan obtuvo cierto reconocimiento con su papel de madre del personaje principal de Wesley Snipes en Blade. Al año siguiente, interpretó un papel en Life, junto a Martin Lawrence y Eddie Murphy, y actuó consecutivamente en The Best Man y The Wood. The Best Man era una película cómica de conjunto, protagonizada por Taye Diggs, Nia Long, Harold Perrineau Jr. y Morris Chestnut. The Best Man se convirtió en una de las diez películas afroamericanas más taquilleras de la historia y Lathan recibió una nominación al premio NAACP Image Award por su interpretación. The Wood, otra película de conjunto protagonizada por Diggs y Omar Epps, la convirtió en el interés amoroso de Epps.
Lathan y Epps volvieron a aparecer en pantalla en Love & Basketball, esta vez interpretando a una pareja tan apasionada por el baloncesto como por el otro. Su actuación en Love & Basketball le valió el Premio NAACP Image 2001 a la mejor actriz de cine, así como una nominación al Premio Independent Spirit a la mejor actriz y un Premio BET. En el año 2000, Lathan apareció en la producción Off-Broadway de Los monólogos de la vagina junto a Teri Garr y Julianna Margulies.
En 2001, Lathan se ganó otros elogios por su trabajo en la película de comedia multicultural Catfish in Black Bean Sauce. A continuación, su segunda colaboración con Prince-Bythewood: Disappearing Acts, basada en una novela de Terry McMillan. En la película de HBO, Lathan interpreta a una aspirante a cantante y compositora enamorada de un carpintero, interpretado por su compañero de reparto en Blade, Wesley Snipes. Por su trabajo en la película, Lathan obtuvo un premio Essence a la mejor actriz. Ese año, fue nombrada por la revista Ebony como una de las 55 personas más bellas y fue galardonada por la revista Essence y Black Entertainment Television.En 2002, Lathan protagonizó la película de comedia romántica Brown Sugar, junto a Diggs, Queen Latifah y Mos Def. La actuación de Lathan le valió una nominación a los premios NAACP Image Award como actriz destacada en una película. La película también recibió una nominación al premio NAACP Image Award a la mejor película.
En 2004, Lathan protagonizó en Broadway A Raisin in the Sun con Sean Combs, Audra McDonald y Phylicia Rashad. Lathan recibió una nominación al Premio Tony a la Mejor Interpretación de una Actriz Principal por su interpretación de Beneatha Younger. Varios años después, Lathan repitió el papel en una producción de la cadena ABC de A Raisin in the Sun.
En 2003, coprotagonizó con Denzel Washington la película Out of Time. Al año siguiente, fue elegida para el papel principal de Alien vs. Predator. La película fue un gran éxito, recaudando más de 171 millones de dólares en todo el mundo.
En 2006, coprotagonizó con Simon Baker la comedia romántica Something New; como Michelle Landau, la esposa mucho más joven de un empresario de Texas (Larry Hagman) durante la cuarta temporada de la serie de televisión Nip/Tuck; y en 2008 como Andrea en The Family That Preys, de Tyler Perry. La película también cuenta con Alfre Woodard y Kathy Bates; se estrenó en Estados Unidos el 12 de septiembre de 2008. En una entrevista con NPR, Lathan dijo que el guión adoptó un nuevo enfoque para contar una historia de amor interracial, describiendo el conflicto interno al que se enfrentan algunas mujeres afroamericanas a la hora de tener citas interraciales. «Siento que con las mujeres negras, en cierto modo, siento que ha sido más difícil para nosotras ir allí sólo en términos culturales. Sé que hay una estadística que dice que el 13% de los hombres negros tienen relaciones interraciales. Y no me cites, pero es como el cuatro o el tres por ciento de las mujeres negras tienen relaciones interraciales; y creo que eso dice mucho sobre, ya sabes, la lealtad de las mujeres negras a su hombre negro o su culpabilidad por salir de la raza».
En 2009, Lathan coprotagonizó con Matthew Broderick el drama Wonderful World. De 2009 a 2013, puso voz al personaje Donna Tubbs en The Cleveland Show. En 2011, Lathan coprotagonizó el thriller de Steven Soderbergh Contagio junto a Matt Damon, Jude Law, Marion Cotillard, Kate Winslet, Gwyneth Paltrow, Bryan Cranston y Laurence Fishburne. En 2011, Lathan protagonizó junto a Anthony Mackie y Forest Whitaker Repentance, un thriller psicológico dirigido por Phillipe Caland.Lathan interpretó a Mona Fredricks en la segunda temporada de la serie original de Starz Boss, protagonizada por Kelsey Grammer.
En 2013, Lathan retomó su papel en la secuela de The Best Man′s, The Best Man Holiday. En 2016, formó parte del reparto de la secuela de Now You See Me titulada Now You See Me 2, que fue un éxito de taquilla, y participó en la película de ciencia ficción Approaching the Unknown. En 2017, Lathan volvió a la televisión con un papel principal en la serie Shots Fired, y también apareció en la película American Assassin. A continuación, Lathan se incorporó al reparto principal de The Affair, apareciendo en su cuarta y quinta temporada, y protagonizó la película de Netflix Nappily Ever After.