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RISULTATI

Studi di inalazione di 21 giorni a confronto tra fumo mainstream e sidestream

Il primo studio sul fumo sidestream all’INBIFO, studio 3047,13-16 è stato uno studio di inalazione di 21 giorni iniziato nel novembre 1981. Ratti maschi Sprague Dawley sono stati esposti a concentrazioni uguali (in base al particolato totale (TPM) per litro) di fumo di sigaretta tradizionale, fumo laterale da una sigaretta che è stato soffiato secondo il protocollo della Federal Trade Commission (FTC),17 e fumo laterale da una sigaretta a combustione libera.14 Poiché il particolato fresco del fumo di sigaretta sidestream ha un diametro aerodinamico medio di massa di 0,23 μM,18 le moderne misure di particolato di PM2,5 e PM3,5 sono equivalenti alle misure TPM utilizzate da INBIFO.

La concentrazione di fumo era 170 μg/l TPM (170 000 μg/m3), circa un terzo della dose massima tollerata determinata da INBIFO precedenti studi di inalazione sul fumo mainstream.19,20 Venti ratti in ogni gruppo di esposizione sono stati esposti al fumo sette ore al giorno per 21 giorni. Il metodo di esposizione era “solo la testa”, il che significa che i ratti sono stati collocati prima la testa in tubi di plastica aderenti con una porzione di testa schermata che si proiettava in un condotto attraverso il quale l’aria fumosa scorreva. I controlli per l’esperimento consistevano in ratti tenuti nelle loro normali gabbie (controlli in gabbia) e ratti che erano stati collocati in tubi di esposizione ma ai quali era stata data aria fresca da respirare (esposizione finta).

Nessuno dei ratti di controllo è morto, un ratto del gruppo di esposizione principale è morto, 11 ratti del gruppo con fumo laterale sono morti o sono stati uccisi in stato moribondo, e 12 ratti del gruppo con fumo laterale libero sono morti o sono stati uccisi in stato moribondo14 (tabella 1). Alla fine delle esposizioni giornaliere, la temperatura corporea media era di 37°C per i ratti esposti allo sham e al controllo della gabbia, 36°C per i ratti esposti al mainstream e 32°C per i ratti esposti al sidestream14 (tabella 1). L’aumento della mortalità indica che il fumo sidestream era più acutamente tossico e il calo della temperatura corporea suggerisce lo shock e la funzione metabolica depressa nei ratti esposti sidestream.21

La frequenza respiratoria dei gruppi di controllo sham e cage era di 107 respiri/min, dei ratti esposti mainstream 91 respiri/min e dei ratti esposti sidestream 86 respiri/min.14 Lo sham e la gabbia ratti di controllo guadagnato peso durante l’esposizione 21 giorni a circa 150% del loro peso corporeo iniziale, il gruppo esposto mainstream raggiunto 130% del loro peso corporeo iniziale, i gruppi esposti sidestream perso peso, scendendo a 80% del loro peso corporeo iniziale 14 (tabella 1). La diminuzione del peso corporeo è stata associata alla diminuzione del consumo di cibo e suggerisce shock e cachessia.21

Dopo 21 giorni di esposizione, il 6% dei ratti esposti al mainstream ha mostrato una leggera atrofia dell’epitelio olfattivo e il 13% ha mostrato una leggera iperplasia delle cellule basali dell’epitelio ciliato nella cavità nasale. Tutti i ratti esposti al sidestream hanno mostrato una pronunciata atrofia o ulcerazione dell’epitelio olfattivo e sia iperplasia che metaplasia delle cellule squamose dell’epitelio ciliato nella cavità nasale, con cornificazione in alcuni casi (tabella 1). I ricercatori hanno concluso che: “l’esposizione al sidestream ha indotto lesioni epiteliali più frequenti e più gravi nell’epitelio olfattivo e ciliato della cavità nasale rispetto al mainstream. Se si estrapola dall’esperienza dei precedenti studi di inalazione mainstream, la concentrazione di materiale particolare totale mainstream di questo studio dovrebbe essere aumentata di un fattore di tre per produrre reazioni forti simili a quelle viste con l’esposizione sidestream in questo studio. “14

Un totale di sette studi di inalazione di 21 giorni che confrontano il fumo mainstream e sidestream sono stati effettuati tra il 1982 e il 1985 (3057,35-37 3061,20,22-24 3069,25-29 3081,30-33 3108,38 311339,40). Quattro di questi studi (3057, 3061, 3069, 3081) hanno utilizzato concentrazioni di fumo sufficienti ad uccidere il 10% o più dei ratti (tabella 1). La perdita di peso e la temperatura rettale inferiore a 33,5°C erano correlate alla mortalità. In media sui quattro studi, il fumo laterale ha causato tassi simili di mortalità ad un terzo della concentrazione (140 μg/l TPM) del fumo principale (469 μg/l).

I tecnici che hanno gestito gli animali hanno anche notato altri, più sottili, segni della tossicità comparativa del fumo di sigaretta laterale. Lo studio 3061 ha confrontato una dose di 380 μg/l TPM mainstream con una dose di 90 μg/l sidestream. I gestori degli animali hanno osservato che: “tutti i ratti trattati con fumo hanno mostrato segni generali di esaurimento dopo la fine dell’esposizione giornaliera. Al contrario di tutti gli altri ratti che si sono ripresi fino al mattino successivo, i ratti del gruppo sidestream più alto hanno continuato a mostrare un pelo arruffato e una temperatura rettale leggermente diminuita. “24 Considerando questi fattori insieme, gli autori delle relazioni di integrazione degli studi 3069 e 3081 hanno dichiarato: “I gruppi esposti al mainstream e al sidestream ad alta dose hanno reagito in modo approssimativamente simile, anche se la concentrazione di TPM nel gruppo esposto al sidestream ad alta dose era approssimativamente un fattore quattro inferiore rispetto a quello esposto al mainstream. “25,41

I risultati dell’esame istopatologico degli epiteli respiratori supportano l’idea che il fumo sidestream è quattro volte più tossico del fumo mainstream per grammo. Confrontato sulla base di TPM, la concentrazione di fumo sidestream sufficiente a causare necrosi del epitelio che rivestono la cavità nasale era 23% che di mainstream (tabella 1). La concentrazione di fumo sidestream sufficiente a causare atrofia dell’epitelio olfattivo era un decimo che di mainstream e la concentrazione di sidestream sufficiente a causare metaplasia squamosa dell’epitelio nasale era un terzo (tabella 1).

Nel marzo 1982, i ricercatori INBIFO confrontato condensati di fumo mainstream e sidestream (raccolti in una trappola impaction) in un test di mutagenesi batterica (306742). Hanno usato il saggio di incorporazione su piastra con microsomi S9 e due ceppi di Salmonella typhimurium, TA 98 (che rileva mutazioni frameshift), e TA 100 (che rileva la sostituzione delle coppie di basi del DNA). Il ceppo TA 98 non ha mostrato alcuna differenza, ma il ceppo TA 100 ha mostrato un’attività superiore del 30% con il condensato di sidestream. Questi risultati suggeriscono che il condensato di sidestream e i suoi prodotti di degradazione metabolica hanno indotto più sostituzioni di coppie di basi per grammo rispetto al condensato mainstream.

Tumorigenesi

Nel 1982, il condensato di fumo sidestream fu incluso in un esperimento di tumorigenesi della pelle di 80 settimane sui topi (306843-45). La metà dei topi ha ricevuto un singolo pretrattamento con 7,12 dimetilbenz(α)antracene (DMBA), la metà no. I composti chimici come il DMBA, che sono sufficienti a causare tumori da soli, sono chiamati iniziatori di tumori. I composti chimici che non causano tumori da soli, ma che aumentano l’incidenza o la molteplicità dei tumori se applicati dopo un iniziatore di tumori, sono chiamati promotori di tumori. Le dosi di condensato di fumo di sigaretta applicate erano di 60, 90, o 120 mg per topo a settimana.

I segni di intossicazione (attività frenetica, posizione prona, ansimare, occhi chiusi) erano più pronunciati tra i topi trattati con sidestream e persistevano più a lungo. Solo il condensato di sidestream ha causato una mortalità dipendente dal dosaggio45 (tabella 2). Tra i topi che non sono stati trattati con DMBA, l’incidenza dei tumori era 3,4-5 volte superiore nei topi trattati con sidestream condensato rispetto ai topi trattati con condensato mainstream (tabella 2), suggerendo che sidestream condensato è un iniziatore di tumore molto più potente di condensato mainstream. Prendendo in considerazione il tempo di sviluppo del tumore, l’incidenza del tumore e la molteplicità del tumore, i ricercatori dell’INBIFO hanno concluso che il condensato sidestream, senza trattamento DMBA, era 2-6 volte più cancerogeno del condensato mainstream e che il condensato sidestream, preceduto dal trattamento DMBA, era 2-3 volte più cancerogeno del condensato mainstream.43

Tossicità acuta

Il primo studio sulla tossicità acuta (307146,47) ha confrontato singole applicazioni di condensato di fumo di sigaretta mainstream e sidestream, che vanno da 100-2115 mg/kg di peso corporeo, nei topi.48 I topi sono stati studiati per due settimane dopo l’applicazione del condensato. La concentrazione LD50 (concentrazione sufficiente a causare la morte nel 50% degli animali) per il condensato di fumo laterale era di 608 mg/kg. Gli animali dipinti con il condensato mainstream non hanno raggiunto il 50% di mortalità durante lo studio, ma la LD50 estrapolata era di 2370 mg/kg. La DL50 del sidestream per l’esposizione cutanea era circa un terzo della DL50 del mainstream.

Lo studio 3099,47 un test di tossicità su cellule di coltura di tessuto polmonare umano, ha anche dimostrato la differenza di tossicità tra il fumo mainstream e sidestream. Le cellule sono state seminate in monostrati confluenti, lasciate attaccare per una notte, ed esposte al fumo fresco.49 Il fumo è stato pompato nello spazio aereo sigillato sopra le cellule polmonari e il mezzo di coltura in concentrazioni variabili e trattenuto per una notte, poi le cellule sono state staccate dalle fiasche e testate per la vitalità la mattina successiva. La DL50 per il fumo laterale era un terzo di quella del fumo principale.49

Nel 1984, la ricerca sul fumo sidestream ha cominciato a passare dagli effetti tossicologici acuti e dalla tumorigenesi a testarne gli effetti su specifici tipi di cellule e sistemi cellulari, nel tentativo di determinare quali componenti chimici rendessero il fumo sidestream unicamente irritante, e di trovare un livello di effetto non osservabile (NOEL) per l’inalazione del fumo sidestream.

Cellule bianche

Tre studi hanno testato l’effetto dell’inalazione del fumo sulle popolazioni di globuli bianchi all’interno del polmone (3108,38 3113,39,40 501550). L’inalazione di fumo mainstream e sidestream non ha avuto effetti così notevolmente diversi su queste cellule come aveva sull’epitelio respiratorio. Entrambi i tipi di fumo aumentato il numero di leucociti polimorfonucleati e macrofagi alveolari polmonari recuperati dai polmoni,38 ma diminuito il numero di leucociti totali recuperati dal sangue.39 I linfociti recuperati dai polmoni di animali esposti mainstream aveva tassi leggermente superiori di proliferazione indotta mitogeno di quelli da animali esposti sidestream.50 I linfociti recuperati da animali esposti sidestream erano meno vitale di quelli da animali esposti mainstream.38,50 I risultati della ridotta vitalità dei linfociti suggeriscono che la capacità immunitaria degli animali esposti al fumo sidestream potrebbe essere ridotta rispetto a quella degli animali esposti al fumo mainstream.51

Base chimica per una maggiore tossicità sidestream

Il primo studio per esaminare la base chimica per la differenza tra il fumo mainstream e sidestream confrontato fumo sidestream e vapore di ammoniaca in un esperimento di inalazione di un giorno con ratti (310452-54). Il fumo sidestream contiene tra 15-300 volte più ammoniaca del fumo mainstream. L’introduzione alla relazione 3104 afferma che: “L’ammoniaca dovrebbe essere uno dei principali complementi irritanti del fumo laterale. “52 Sono state testate cinque concentrazioni di fumo laterale, comprese tra 13 e 253 μg/l di TPM. Le cinque concentrazioni di vapore di ammoniaca testate andavano da 51 μg/l (circa l’ammoniaca contenuta in 253 μg/l TPM sidestream) a 414 μg/l (circa 10× l’ammoniaca contenuta in 253 μg/l TPM sidestream).

Dodici dei 20 ratti esposti alla più alta concentrazione sidestream sono morti. Nessuno dei ratti nei gruppi con ammoniaca è morto.52 In media per tutte le sette ore, la frequenza respiratoria dei ratti nel gruppo con il più alto dosaggio di sidestream era meno della metà di quella dei controlli finti. La frequenza respiratoria dei ratti nel gruppo con il più alto dosaggio di ammoniaca era uguale a quella dei controlli finti.52 Alle concentrazioni di sidestream più alte, la temperatura corporea dei ratti è scesa costantemente durante le sette ore di esposizione, da 37°C fino a 30°C, ma la temperatura dei gruppi con ammoniaca non è cambiata. Gli scienziati dell’INBIFO hanno concluso che il fumo di sidestream è 10 volte più irritante del vapore di ammoniaca che contiene.52

Lo studio 506155 era un follow up dello studio 3104. Ha testato gli effetti di cinque sostanze chimiche che si trovano in alte concentrazioni nel fumo laterale – formaldeide, acetaldeide, acroleina, ammoniaca e isoprene – in un’esposizione di tre giorni che ha misurato la quantità di anidride carbonica espirata dai ratti.55 Le variazioni nella quantità di anidride carbonica espirata indicano cambiamenti sia nella frequenza respiratoria che nel volume corrente. La diminuzione della frequenza respiratoria e i respiri poco profondi sono risposte all’irritazione sensoriale.56 Lo studio ha scoperto che la combinazione di tutti e cinque i composti, alle concentrazioni in cui sono presenti nel fumo laterale, era solo il 10-20% più irritante del fumo laterale intero.55

Lo studio successivo (312457-61) per esaminare la base chimica della tossicità del fumo sidestream ha confrontato gli effetti del fumo sidestream intero, la fase particellare del fumo sidestream, la fase gas e vapore del fumo sidestream, e un sidestream ricombinato composto dalla fase particellare e dalla fase gas e vapore. I ratti sono stati esposti ai diversi fumi per sette ore al giorno per tre giorni. La respirazione, i sintomi di irritazione, la temperatura corporea e il peso corporeo sono stati monitorati, poi i ratti sono stati uccisi e le loro vie respiratorie sono state esaminate.

Il fumo intero è stato il più irritante, seguito dalla fase gas/vapori, la fase di fumo ricombinato e infine la fase del particolato.58 La fase gas/vapori aveva effetti molto più forti sull’epitelio che riveste il tratto respiratorio rispetto alla fase del particolato.60 L’incidenza di iperplasia e metaplasia era più alta tra gli animali esposti alla fase gas/vapori che tra quelli esposti alla fase del particolato.60 L’unico sito all’interno del tratto respiratorio in cui la fase del particolato ha fatto più danni della fase gas/vapore è stata la laringe anteriore,60 probabilmente perché la laringe anteriore è il sito principale di impatto delle particelle inalate nel ratto.62

L’esperimento 506263 ha confrontato gli effetti sull’epitelio respiratorio superiore del fumo intero sidestream, della fase gas/vapore sidestream e di una miscela di formaldeide, acroleina e ammoniaca al doppio della concentrazione in cui questi composti sono presenti nel fumo intero sidestream. La miscela ha causato circa il 35% del danno causato dal fumo intero sidestream.63

L’esperimento 312664-66 ha confrontato il fumo sidestream delle sigarette 2R1 con il sidestream di una sigaretta non di tabacco, il sidestream della sigaretta non di tabacco con aggiunta di nicotina, e aerosol di nicotina pura, formaldeide, acetaldeide, acroleina e ammoniaca. Le concentrazioni degli aerosol di singole sostanze chimiche sono stati scalati in modo che la concentrazione più alta sarebbe circa il doppio della concentrazione di quel componente in 2R1 smoke.

I punti finali valutati incluso l’aumento di peso, anidride carbonica (CO2) esalazione, e istopatologia del tratto respiratorio. Il fumo 2R1 ha diminuito maggiormente l’aumento di peso, seguito dalla sigaretta senza tabacco con aggiunta di nicotina, dalla sigaretta senza tabacco, poi dalla nicotina pura e dall’acroleina.66 Il fumo 2R1 e la nicotina, alle loro più alte concentrazioni, hanno diminuito la temperatura corporea di 5°C e 3,5°C, rispettivamente.66 Le concentrazioni medie e più alte del fumo 2R1 hanno diminuito l’esalazione di CO2 di circa il 50%.66 La più alta concentrazione di nicotina pura ha diminuito l’esalazione di CO2 di circa il 20%.66 L’aerosol di acroleina aveva il 20-25% dell’effetto del fumo 2R1 sull’istopatologia dell’epitelio respiratorio.64 Nella laringe, la più alta concentrazione di aerosol di acroleina ha causato quasi tanto ispessimento dell’epitelio quanto il fumo 2R1.64 Formaldeide, acetaldeide, e ammoniaca non avevano effetti. Presi insieme, questi esperimenti dimostrano che anche se l’acroleina e la nicotina possono spiegare alcuni degli effetti del fumo sidestream, il fumo intero è più tossico della somma degli effetti dei suoi componenti principali.

Nessun livello di effetto osservabile

Una serie di esperimenti è iniziata nel 1985 che è stato progettato per confrontare diversi metodi di esposizione e trovare NOEL per l’esposizione a breve termine (21-90 giorni) esposizioni di fumo fresco sidestream utilizzando concentrazioni da 2-20 μg/l TPM e tre diversi metodi di esposizione al fumo. Il metodo utilizzato nello studio 311467,68 era solo la testa, il metodo standard utilizzato in tutti gli esperimenti precedenti. Gli studi 312569 e 312770 hanno utilizzato un’esposizione solo al naso. Questo approccio richiedeva una camera di esposizione più restrittiva e comportava un maggiore stress per gli animali. I ratti esposti per finta, confinati in tubi di esposizione solo al naso e con aria fresca da respirare, pesavano il 20% in meno dei ratti di controllo in gabbia. Lo studio 312334,71-73 ha utilizzato un’esposizione di tutto il corpo. Nel sistema di esposizione del corpo intero, gli animali sono stati esposti al fumo mentre erano nelle loro gabbie, muovendosi liberamente in gruppi di due, invece di essere confinati da soli in un tubo di esposizione.

Studio 311467,68 testato fumo sidestream a 3, 5, e 17 μg/l TPM. I ratti sono stati divisi in due gruppi, uno che riceveva il fumo per 3,5 ore al giorno e l’altro per 7 ore al giorno. Hanno anche testato gli effetti di un periodo di recupero di 14 giorni dopo l’esposizione al fumo. Sulla base dei risultati, gli scienziati INBIFO proposto diversi NOEL per ogni sito all’interno del tratto respiratorio superiore: 2 μg / l per l’iperplasia delle cellule di riserva dell’epitelio nella parte anteriore del naso, 17 μg / l per cornificazione dell’epitelio nella parte anteriore del naso e atrofia dell’epitelio olfattivo, e tra 2-17 μg / l per iperplasia dell’epitelio delle corde vocali a seconda del sito esatto all’interno delle corde vocali (tabella 3). (Questi livelli non sono veri NOEL, poiché alcuni effetti sono stati ancora osservati.) Tutti i cambiamenti osservati all’epitelio respiratorio causati da 21 giorni di inalazione erano reversibili dopo 14 giorni di recupero.

Lo studio 312334,71-73 ha misurato gli effetti di concentrazioni più elevate di fumo laterale (20 e 60 μg/l TPM) utilizzando un sistema di esposizione del corpo intero. I tecnici responsabili di mantenere la concentrazione di fumo ai livelli specificati hanno campionato il fumo appena prima che fosse rilasciato nelle gabbie e dall’interno delle gabbie e hanno notato che: “Le concentrazioni “reali” nelle gabbie erano inferiori a quelle determinate all’ingresso per il fattore 0,8-0,9 per il TPM, 0,6-0,8 per la nicotina, 0,3 per l’ammoniaca e 0,4-0,5 per la formaldeide. Con gli altri componenti il fattore era quasi uno. “71 Le concentrazioni più basse di alcuni componenti del fumo si riflettevano in danni meno gravi alle vie respiratorie.72 Nonostante le basse concentrazioni di fumo e le camere di esposizione non restrittive, i ratti esposti al fumo mostravano ancora diminuzioni nell’aumento di peso di circa il 15%71 (tabella 3).

Gli studi 312569 (21 giorni) e 312770 (90 giorni) hanno testato il TPM a 2 μg/l e 6 μg/l con esposizione solo al naso. Nell’esposizione di 21 giorni nessuna delle due concentrazioni ha causato iperplasia nell’epitelio nasale, mentre la concentrazione di 6 μg/l ha causato iperplasia e leggera metaplasia nelle corde vocali (tabella 3), nonché una diminuzione dell’aumento di peso del 12% per il gruppo a bassa concentrazione e del 24% per quello ad alta concentrazione.74 Nello studio di 90 giorni entrambi i dosaggi hanno causato iperplasia nell’epitelio nasale e nelle corde vocali70 (tabella 4), ma non ci sono stati effetti sull’aumento di peso. A 6 μg/l TPM per 90 giorni c’era una metaplasia significativa alle corde vocali. Il danno all’epitelio respiratorio ad entrambe le concentrazioni era più grave e più prevalente dopo 90 giorni che dopo 21 giorni70 (tabella 4), il che dimostra che esposizioni più lunghe al fumo laterale causano danni più gravi alle vie respiratorie.