Heading

Abstract

Introduzione. Il sistema del Purkinje e i falsi tendini (FT) sono legati all’aritmia ventricolare, ma l’associazione tra le fibre di Purkinje e i FT non è chiara. Questo studio ha indagato le associazioni delle caratteristiche anatomiche ed elettrofisiologiche tra le fibre di Purkinje e le FT. Metodi e risultati. Abbiamo ottimizzato il protocollo di colorazione con soluzione di iodio di Lugol delle fibre di Purkinje per studiare la struttura anatomica e abbiamo creato un nuovo metodo di mappatura elettrofisiologica, chiamato metodo DVM (Direct Visual Mapping), per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche. Utilizzando le suddette innovazioni in 12 cani, abbiamo trovato quanto segue. (1) Non c’era nessuna fibra di Purkinje trovata a 0,5 cm-1,0 cm sotto l’anulus della valvola o sui foglietti o sulle corde tendinee della valvola mitrale o adiacente al 1/3 superiore del muscolo papillare. (2) Le fibre di Purkinje esistevano in tutte le FT, comprese le FT piccole e minuscole. (3) Le fibre di Purkinje contenute nelle FT si estendevano dall’estremità prossimale a quella distale, e le loro caratteristiche elettrofisiologiche erano simili alle fibre sull’endocardio, compresa la conduzione anterograda, retrograda e decrementale e l’automaticità. Conclusioni. Le fibre di Purkinje si trovano comunemente in FTs. Le caratteristiche elettrofisiologiche delle fibre di Purkinje contenute nelle FT sono simili alle fibre sull’endocardio. Le FT potrebbero avere una base anatomica ed elettrofisiologica per l’aritmia ventricolare.

1. Introduzione

La rete di Purkinje è un sistema di conduzione specializzato all’interno del cuore responsabile della conduzione elettrica dei ventricoli, ed è anche coinvolto nel meccanismo di alcune tachiaritmie ventricolari (chiamate aritmie Purkinje-related), tra cui la tachicardia ventricolare monomorfa (VT), la VT polimorfa e la fibrillazione ventricolare (VF). Il falso tendine (FT) è una comune variazione anatomica intraventricolare. Si riferisce a una struttura fibroide o fibromuscolare che esiste nel ventricolo oltre alla normale connessione del muscolo papillare e della valvola mitrale o tricuspide. Molti studi clinici hanno dimostrato che le FT sono strettamente legate alle aritmie ventricolari. La tachicardia ventricolare sinistra idiopatica (ILVT) è una comune aritmia ventricolare rientrante che origina dal ventricolo sinistro. È stato riportato che il suo substrato anatomico è strettamente correlato alla FT. Le FT sono anche legate al verificarsi di battiti prematuri ventricolari. FTs ha la base anatomica ed elettrofisiologica per l’aritmia ventricolare? In alcuni studi precedenti, le cellule di Purkinje sono state trovate nelle FT. Tuttavia, l’esistenza di fibre di Purkinje in FTs è una coincidenza o un fenomeno comune? Se queste fibre di Purkinje hanno proprietà di conduzione elettrica e che ruolo hanno queste fibre di Purkinje nelle aritmie ventricolari non è stato ben studiato.

2. Materiali e metodi

2.1. Isolamento e preparazione del cuore

Tutti i protocolli per gli esperimenti sugli animali in questa ricerca sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Ospedale Generale del Northern Theater Command. Tutte le procedure negli esperimenti sugli animali erano in piena conformità con le raccomandazioni sugli studi sugli animali secondo la Dichiarazione di Helsinki dell’Associazione Medica Mondiale e le linee guida europee (2010/63/UE) per la cura e l’uso degli animali da laboratorio.

Dodici cani bastardi (21,5 ± 2,5 kg) sono stati utilizzati in questa ricerca. Questi cani sono stati anestetizzati con midazolam (0,5 mg/kg IM) e poi messi a morte iniettando aria (100-150 ml) nella loro vena femorale. I cuori sono stati raccolti attraverso un approccio di sternotomia mediale immediatamente dopo la morte. Secondo i diversi scopi sperimentali, i cuori sono stati preparati ed elaborati il più presto possibile. L’endocardio di sei cuori è stato colorato dalla soluzione di Lugol per osservare la struttura anatomica delle fibre di Purkinje. Altri sei cuori sono stati usati per osservare le caratteristiche elettrofisiologiche del sistema di Purkinje con un metodo di mappatura visiva. Il metodo di preparazione del cuore per la colorazione della soluzione di Lugol e la mappatura visiva era il seguente. In primo luogo, il cuore in vitro è stato inciso dall’anulus della valvola mitrale all’apice lungo il ventricolo sinistro a parete libera, e l’anello aortico è stato inciso per esporre completamente i muscoli papillari anteriore e posteriore del ventricolo sinistro. Poi, l’endocardio è stato relativamente appiattito, e il sangue residuo sull’endocardio è stato eliminato utilizzando un tampone di cotone.

2.2. Colorazione con la soluzione di Lugol

La soluzione di Lugol è stata preparata in anticipo (meno di una settimana) sciogliendo I2 (4%, ) e KI (4%, ) in acqua deionizzata in condizioni miti, ed è stata protetta dalla luce. La soluzione di Lugol è stata spruzzata uniformemente sull’endocardio di un cuore preparato e lasciato in ammollo per 0,5-2 minuti per colorare le fibre di Purkinje. Il processo di colorazione è stato ripetuto se il colore è sbiadito o scomparso. Un microscopio stereoscopico (lente anatomica) è stato utilizzato per rivelare strutture anatomiche piccole o complesse.

2.3. Colorazione istologica

I cuori sono stati fissati in formalina al 10%, inclusi in paraffina e sezionati in fette da 5 μm. Le sezioni di tessuto sono state colorate con colorazione ematossilina-eosina (HE), colorazione di Masson, colorazione acido periodico Schiff (PAS), e colorazione immunoistochimica della connexina 40.

2.4. Metodo di mappatura visiva diretta

Il cuore preparato è stato immerso in una soluzione riscaldata (37°C) di Ringer lattato. Due cateteri ad alta densità di 20 elettrodi (elettrodo 1 mm; 1 mm di distanza) sono stati collocati strettamente sulla regione di interesse sotto visione diretta, come il ramo delle fibre di Purkinje, muscoli papillari anteriori o posteriori, e FTs. Poi, lo studio elettrofisiologico e la mappatura, tra cui la stimolazione programmata, la mappatura di attivazione, e la mappatura del ritmo, sono stati eseguiti in vitro. Il cuore è stato immerso in freddo (<10°C) soluzione di Ringer lattato per cinque secondi, se l’aritmia sostenuta (come VT o VF) non era pace terminable o attività elettrica automatica doveva essere arrestato. Questo metodo di mappatura endocardica è definito metodo di mappatura visiva diretta (DVM).

3. Risultati

3.1. Le caratteristiche anatomiche delle fibre di Purkinje

Il sistema His-Purkinje sinistro ha avuto origine sotto il confine tra il seno noncoronarico e il seno coronarico destro. Ha dato origine a un ramo del fascio sinistro e destro. Non c’era nessun ramo di fibra di Purkinje trovato 0,5 cm-1,0 cm sotto l’anulus della valvola, compresa la valvola aortica e la valvola mitrale, tranne il fascio di His sinistro tra il seno noncoronarico e il seno coronarico destro. Non c’era nessun ramo della fibra di Purkinje sui foglietti o corde tendinee della valvola mitrale. I rami principali dei rami anteriori o posteriori di sinistra si sono estesi ai FT che si sono collegati alle pareti laterali dei muscoli papillari. Tuttavia, nessun ramo della fibra di Purkinje è stato trovato adiacente al 1/3 superiore del muscolo papillare (Figura 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

(f)

Figura 1

La distribuzione delle fibre di Purkinje nell’endocardio ventricolare sinistro. (a, d) Non c’era nessun ramo di fibra di Purkinje trovato entro 0,5 cm sotto la valvola mitrale; (b, e) ha mostrato che non c’era nessun ramo di fibra di Purkinje trovato entro 0,8 cm sotto la valvola aortica; (c, f) non c’era nessun ramo di fibra di Purkinje trovato sulla punta dei muscoli papillari. MVL, foglietto della valvola mitrale; LCC, cuspide coronarica sinistra; RCC, cuspide coronarica destra.

3.2. Le caratteristiche anatomiche delle FT

Le FT sono state trovate sull’endocardio in tutti i 12 cani e la lunghezza variava. In tutto, 19 FT erano più lunghe di 1 cm (2,4 ± 1,03 cm in media; da una a tre FT in ciascuno dei 12 cani). Inoltre, c’erano 66 FT più piccoli che andavano da 0,5 a 1 cm di lunghezza (da due a otto FT in ciascuno dei 12 cani), e i piccoli FT (meno di 0,5 cm) erano più diffusi in ogni cane. Tra i 19 FT più lunghi, cinque si collegavano ai muscoli papillari anteriori, 12 si collegavano ai muscoli papillari posteriori e i due rimanenti non si collegavano a nessun muscolo papillare. Tutti i FT contengono fibre di Purkinje, compresi i FT più piccoli e minuscoli. Le fibre di Purkinje contenute nelle FT si estendono dall’estremità prossimale a quella distale e collegavano le fibre di Purkinje endocardiche ai muscoli papillari o alle fibre di Purkinje endocardiche adiacenti (Figura 2). È interessante notare che esisteva un tipico miocardio funzionante e vasa vasorum nelle FT più grandi (Figura 3). Al contrario, non c’era nessuna fibra di Purkinje o miocardio contenuto nelle corde tendinee (veri tendini), che collegavano i muscoli papillari al foglietto della valvola mitrale (Figura 2).

(a)

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

(g)

(h)

Figura 2

Le caratteristiche di distribuzione delle fibre di Purkinje sulle corde tendinee (veri tendini) e FT. (a) Colorazione del liquido di Lugol nell’endocardio di un cane: Le fibre di Purkinje sono state colorate più scure. (b, c, e d) Nessuna fibra di Purkinje contenuta nelle corde tendinee collegate alla valvola mitrale. (b) La regione triangolare allargata di (a). (c) Colorazione di Masson delle corde tendinee (×100). (d) colorazione immunoistochimica della Connexin 40 delle corde tendinee (×100). (e, f, g, e h) Tutte le FT contengono fibre di Purkinje. (e) La regione allargata a stella di (a) (×5). (f) La regione allargata area rettangolare di (e) (g) colorazione di Masson di FTs (×100). (h) Connexin 40 colorazione immunoistochimica di FTs (×100).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)

(d)

Figura 3

Fibre di Purkinje, tipico miocardio di lavoro, e vasa vasorum nel più grande FTs (×50). (a) colorazione HE; (b) colorazione di Masson; (c) colorazione PAS; (d) colorazione immunoistochimica della connexina 40. M, miocardio funzionante; , fibre di Purkinje; freccia nera, vasa vasorum.

3.3.

Utilizzando il metodo DVM, l’attività elettrica delle fibre di Purkinje è stata registrata sull’endocardio ventricolare dei cuori raccolti stimolando il ventricolo sinistro o registrando l’attività elettrica automatica. L’attivazione elettrica del cuore raccolto poteva essere registrata in 38 min∼80 min (56,5 ± 15,1 min).

Le caratteristiche elettrofisiologiche delle fibre di Purkinje sulle FT erano simili alle fibre sull’endocardio, compresa la conduzione bidirezionale e l’automaticità (Figura 4). Conduzione decrescente è stato trovato anche in fibre di Purkinje su FTs (Figura 4), soprattutto durante la lesione meccanica da trazione leggera. Più righe di potenziali Purkinje sono stati registrati nella zona di sovrapposizione di FT (Figura 5).

Figura 4

Mappatura elettrofisiologica dell’endocardio utilizzando il metodo DVM. (a) Due 20-elettrodi cateteri di mappatura sono stati posizionati al endocardio setto LV dal setto superiore all’apice. Un catetere di mappatura (P1-P20) è stato bloccato su uno dei FT, e l’altro (P21-P40) è stato posto alla rete Purkinje adiacente. Punto di stimolazione si trova all’estremità prossimale di FT (stella rossa). (b) colorazione liquido di Lugol nell’endocardio del cane: Le fibre di Purkinje sono state tinte più scure. (c) Quando pacing dal FT prossimale, alla lunghezza del ciclo di 400 ms, la direzione di conduzione delle fibre di Purkinje contenute nel FT era dal prossimale alla fine distale, e la direzione di conduzione delle fibre di Purkinje sull’endocardio apicale era dal distale alla fine prossimale. Dopo aver fermato la stimolazione, è stata osservata l’automaticità delle fibre di Purkinje dai FT (i quattro agli otto battiti). (d) Quando la stimolazione ad una lunghezza del ciclo di 250 ms, conduzione decrementale delle fibre di Purkinje si è verificato, e le sequenze di attivazione delle fibre di Purkinje erano gli stessi di quella di 400 ms stimolazione (c).

(a)

(a)

(b)

(a)

Figura 5

Potenziali multipli sono stati registrati nella zona di sovrapposizione di FTs. (a) Un catetere di mappatura 20-eletrode è stato posizionato nella zona di sovrapposizione di FTs; (b) più righe di potenziali Purkinje sono stati registrati.

4. Discussione

4.1. Risultati principali

Le fibre di Purkinje sono ampiamente distribuite in FTs, che ha collegato le fibre di Purkinje endocardiche alle fibre di Purkinje dei muscoli papillari o endocardio adiacente. Le caratteristiche elettrofisiologiche delle fibre di Purkinje contenute nelle FT erano simili alle fibre di Purkinje sull’endocardio.

4.2. La distribuzione anatomica del sistema di Purkinje nell’endocardio ventricolare sinistro

La distribuzione delle fibre di Purkinje nell’endocardio ha certe caratteristiche. In questo studio, anche se le fibre di Purkinje sono ampiamente distribuite nell’endocardio, non c’è nessun ramo di fibre di Purkinje sotto la valvola mitrale e il 1/3 superiore del muscolo papillare. Non c’è nessun ramo di fibre di Purkinje nel tratto di efflusso ventricolare sinistro sotto la valvola aortica, tranne il fascio di His sinistro tra il seno noncoronarico e il seno coronarico destro (Figura 1). Queste caratteristiche sono molto importanti per analizzare i meccanismi delle aritmie ventricolari. Per esempio, quando si mappano i complessi ventricolari prematuri (PVC) originati dall’area del RCC, i potenziali ad alta frequenza sono comunemente registrati adiacenti al RCC davanti alle onde QRS dei PVC. I potenziali non devono essere considerati come potenziale della fibra di Purkinje.

4.3. Le caratteristiche anatomiche ed elettrofisiologiche delle FT

Le FT sono strutture singole o multiple, sottili, fibrose o fibromuscolari che attraversano la cavità del ventricolo sinistro e non hanno connessione con le cuspidi valvolari. Le FT sono molto comuni nell’endocardio canino. È stato riportato che le FT contengono tessuti fibrosi, fibre miocardiche, fibre di Purkinje e vasi sanguigni. Le cellule di Purkinje non sono state osservate nei campioni studiati.

Abbiamo trovato che le fibre di Purkinje erano comunemente presenti nelle FT, comprese le FT piccole e minuscole. Le fibre di Purkinje contenute nelle FT si estendono dall’estremità prossimale a quella distale (Figura 2). Le caratteristiche elettrofisiologiche delle fibre di Purkinje contenute nelle FT erano simili a quelle delle fibre sull’endocardio, compresa la conduzione bidirezionale, la conduzione decrementale e l’automaticità (Figure 4 e 5). I diversi componenti delle FT non sono gli stessi: alcuni contengono fibre di collagene e fibre di Purkinje, e alcuni contengono anche fibre miocardiche e vasi nutritivi (Figura 3).

Ipotizziamo che la correlazione tra le FT e il sistema di fibre di Purkinje potrebbe fornire una base anatomica ed elettrofisiologica per le FT che partecipano all’aritmia ventricolare. Quando il sistema delle fibre di Purkinje (comprese le FT) è affetto da trazione meccanica, ischemia, ipossia o altri fattori, le sue caratteristiche elettrofisiologiche potrebbero cambiare di conseguenza, dando luogo ad aritmie ventricolari.

4.4. Implicazioni cliniche

La prevalenza riportata di FT nei pazienti sottoposti a ecocardiografia è variata ampiamente tra lo 0,8% e il 61% nei bambini e tra lo 0,3 e il 71% negli adulti. Alcuni studi hanno riferito che le FT potrebbero svolgere un ruolo importante nelle aritmie ventricolari, come il VT fascicolare idiopatico o il VT nelle cardiopatie strutturali, soprattutto in alcuni pazienti con cardiopatia ischemica. Suwa et al. hanno riferito che ILVT non era più indotta dopo la resezione chirurgica di FTs. Tuttavia, le caratteristiche anatomiche ed elettrofisiologiche delle FT legate alle aritmie ventricolari non sono state ben chiarite.

A causa della correlazione tra fibre di Purkinje e FT, le FT possono essere coinvolte in una varietà di aritmie ventricolari. Per esempio, il meccanismo alla base della tachicardia ventricolare fascicolare sinistra (LPF-VT) è stato dimostrato essere il rientro che coinvolge il sistema di conduzione ventricolare sinistro. Tuttavia, l’esatto circuito di rientro, in particolare il substrato della zona di conduzione lenta, rimane poco chiaro. In pochi casi con LPF-VT, un FT che collega la porzione settale della LPF e i muscoli papillari è stato identificato per essere una parte del circuito di rientro. Tuttavia, nella maggior parte dei casi con LPF-VT, FT notevole non poteva essere rilevato. Nel presente studio, sono stati trovati minuscoli FT che collegano la rete di Purkinje adiacente sull’endocardio. Abbiamo ipotizzato che il minuscolo FT potrebbe svolgere un ruolo importante nel circuito rientrante di LPF-VT. La brusca svolta o la conduzione anisotropa tra FT e la rete di Purkinje adiacente potrebbe essere il substrato della zona di conduzione lenta (Figura 6).

(a)

(a)

(b)

(b)

(c)

(c)

(d)

(e)

(a)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figura 6

Lo schema della nostra ipotesi sui possibili circuiti rientranti della tachicardia ventricolare fascicolare sinistra idiopatica. (a) La struttura anatomica e il modello di conduzione della rete di Purkinje durante il ritmo sinusale. Durante il ritmo sinusale, il ramo principale del sistema His-Purkinje (la gerarchia apicale) esposto sequenza di attivazione antegrade (P2, linee rosse e frecce) e poi retrogradamente attivato la rete Purkinje sulla gerarchia basale (P1, linee blu e frecce). La linea verde e le frecce rappresentavano il piccolo FT tra la rete di Purkinje sulla stessa gerarchia basale o su gerarchie diverse. (b) Durante il VT, il circuito rientrante era intorno alla rete di fibre di Purkinje, che potrebbe essere collegato dal piccolo FT come zona di conduzione lenta (linee rosse e frecce). Da notare che il fascicolo posteriore sinistro (P2) era uno spettatore del circuito di rientro. (c) Durante il VT in rari casi, la zona di conduzione lenta proveniva da un FT più lungo che collegava la rete di Purkinje e i muscoli papillari (linee rosse e frecce). (d) La possibile base anatomica del VT fascicolare sinistro idiopatico in (b) (e) La possibile base anatomica del VT fascicolare sinistro idiopatico in (c) LPF, fascicolo posteriore sinistro; LAF, fascicolo anteriore sinistro; LLPF, fibre di Purkinje di gerarchia inferiore o basale; PM, muscolo papillare.

4.5. Limitazioni

Ci sono state diverse limitazioni nel presente studio. In primo luogo, questo era uno studio animale in vitro, e le proprietà elettrofisiologiche potrebbero essere diverse in qualche misura da quelle di un modello di cuore in vivo o in perfusione Langendorff. In secondo luogo, la durata disponibile per la mappatura visiva delle caratteristiche elettrofisiologiche delle fibre di Purkinje in dettaglio era limitata. In terzo luogo, le caratteristiche delle FT più piccole e minuscole e la loro risposta al verapamil o alla catecolamina non sono state ben chiarite in questo studio. Ulteriori ricerche dovrebbero essere condotte sulle caratteristiche istologiche ed elettrofisiologiche delle FT piccole e minuscole.

5. Conclusioni

Le fibre di Purkinje sono ampiamente distribuite nelle FT canine, comprese le FT piccole e minuscole. Le fibre di Purkinje contenute nelle FT si estendono dall’estremità prossimale a quella distale, collegando anatomicamente ed elettrofisiologicamente il sistema di fibre di Purkinje endocardico, che potrebbe essere il substrato importante per le aritmie ventricolari.

Data Availability

I dati statistici e di immagine usati per sostenere i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse riguardanti la pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il dottor Hongyue Wang per la sua assistenza tecnica sulla colorazione istologica e il dottor Shehata per la revisione della lingua. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Project of Research and Development (contratto n. 2016YFC0900900, 2017YFC1307800, e 2016YFC1301300).