La clonazione del DNA può essere eseguita spontaneamente dalla cellula per scopi riproduttivi. Questa è una forma di riproduzione asessuata in cui un organismo si divide in frammenti e poi ognuno di questi frammenti si sviluppa in individui maturi e completamente cresciuti che sono cloni dell’organismo originale (vedi frammentazione riproduttiva). In questo caso, la frammentazione del DNA è una tecnica di genetica molecolare che permette ai ricercatori di utilizzare la tecnologia del DNA ricombinante per preparare un gran numero di molecole di DNA identiche.Affinché la clonazione del DNA possa essere completata, è necessario ottenere discrete, piccole regioni del DNA di un organismo che costituiscono geni specifici. Solo molecole di DNA relativamente piccole possono essere clonate in qualsiasi vettore disponibile. Pertanto, le lunghe molecole di DNA che compongono il genoma di un organismo devono essere scisse in frammenti che possono essere inseriti nel DNA del vettore. Due enzimi facilitano la produzione di tali molecole di DNA ricombinante:
1. Enzimi di restrizioneGli enzimi di restrizione sono endonucleasi prodotte dai batteri che tipicamente riconoscono piccole sequenze di coppie di basi (chiamate siti di restrizione) e poi tagliano entrambi i filamenti di DNA in questo sito. Un sito di restrizione è tipicamente una sequenza palindromica, il che significa che la sequenza del sito di restrizione è la stessa su ogni filamento di DNA quando viene letta in direzione 5′ a 3′.Per ogni enzima di restrizione, i batteri producono anche un enzima di modifica in modo che il DNA del batterio ospite sia protetto dalla scissione. Questo viene fatto modificando il DNA dell’ospite in corrispondenza o in prossimità di ogni potenziale sito di scissione. L’enzima di modifica aggiunge un gruppo metile a una o due basi, e la presenza di questo gruppo metile impedisce all’endonucleasi di restrizione di tagliare il DNA.
Molti enzimi di restrizione effettuano tagli sfalsati nei due filamenti di DNA al loro sito di riconoscimento, Questo genera frammenti con una “coda” a singolo filamento che sporge alle due estremità, chiamata estremità appiccicosa. Gli enzimi di restrizione possono anche effettuare tagli dritti nei due filamenti di DNA al loro sito di riconoscimento, il che genera estremità smussate. 2. DNA ligasiDurante la normale replicazione del DNA, la DNA ligasi catalizza l’unione end-to-end (legatura) di brevi frammenti di DNA, chiamati frammenti Okazaki. Ai fini della clonazione del DNA, la DNA ligasi purificata viene utilizzata per unire covalentemente le estremità di un frammento di restrizione e del DNA vettore che hanno estremità complementari. La DNA ligasi può legare estremità complementari appiccicose e smussate, ma la legatura delle estremità smussate è inefficiente e richiede una maggiore concentrazione sia di DNA che di DNA ligasi rispetto alla legatura delle estremità appiccicose. Per questo motivo, la maggior parte degli enzimi di restrizione usati nella clonazione del DNA fanno tagli sfalsati nei filamenti di DNA per creare estremità appiccicose.
La chiave per clonare un frammento di DNA è di collegarlo a una molecola di DNA vettore che può replicarsi all’interno di una cellula ospite. Dopo che una singola molecola di DNA ricombinante (composta da un vettore più un frammento di DNA inserito) viene introdotta in una cellula ospite, il DNA inserito può essere replicato insieme al vettore, generando un gran numero di molecole di DNA identiche.Lo schema di base può essere riassunto come segue:
Vettore + Frammento di DNA↓ DNA ricombinante↓ Replicazione del DNA ricombinante all’interno della cellula ospite↓ Isolamento, sequenziamento e manipolazione del frammento di DNA purificato
Ci sono numerose variazioni sperimentali a questo schema, ma questi passi sono essenziali per la clonazione del DNA in un laboratorio.