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2.1. Proprietà di crescita di S. boulardii

Per caratterizzare ulteriormente questo lievito, le sue proprietà di crescita a diverse temperature sono state confrontate con altri ceppi di lievito diploide (tutti i ceppi di lievito utilizzati sono riassunti nella tabella 1). S. boulardii (manterrò questo nome nel testo anche se è un ceppo di S. cerevisiae) cresce bene su un terreno ricco a 30°C e a 37°C ma non a 40°C (Figura 1A). La crescita a 37°C – anche se non ideale – non è insolita per i ceppi di lievito come il ceppo diploide BY4743 (un derivato di S288C) ma al contrario del ceppo diploide RH2585/2586 (un derivato di Σ1278b) che difficilmente cresce a 37°C (Figura 1A). In questo senso, la crescita a 37°C non è una proprietà particolare e unica di S. boulardii. Probabilmente riflette piuttosto il suo adattamento a climi caldi come quelli che si trovano spesso in Indocina.

Un’ulteriore proprietà studiata è la potenziale capacità di S. boulardii di formare filamenti. A questo scopo, è stato coltivato su piastre SLAD che portano solo concentrazioni limitanti di solfato di ammonio (50 μM, circa 1000× meno del convenzionale terreno minimo SD). Come osservato al microscopio, il ceppo diploide RH2585/2586 mostra chiaramente proprietà filamentose in tali condizioni limitanti di ammonio (Figura 1B). La delezione del gene FLO8 che codifica un fattore trascrizionale richiesto per la filamentazione e l’adesione ha completamente abolito le sue proprietà filamentose. Flo8 è richiesto per esprimere, per esempio, Flo11, una glicoproteina della superficie cellulare. Al contrario di RH2585/2586, S. boulardii non ha mostrato quasi nessuna proprietà di filamentazione. È interessante notare che il sequenziamento del gene FLO8 amplificato dalla PCR di S. boulardii ha indicato che non porta un codone di stop prematuro (non mostrato) trovato in ceppi di lievito non filamentosi come quelli derivati da S288C. Quindi, altri geni a monte o a valle richiesti per la filamentazione sono probabilmente disfunzionali in S. boulardii. La sua mancanza di filamentazione spiega probabilmente la sua bassa tossicità e la sua mancanza di capacità di insediamento nel tratto gastrointestinale che altrimenti potrebbe renderlo più persistente e quindi più problematico per le applicazioni mediche.

Un’altra questione interessante è stata quella di indurre la meiosi e la sporulazione in S. boulardii al fine di ottenere progenie aploide. A questo scopo, le cellule diploidi sono state incubate in un mezzo liquido con azoto limitante e una concentrazione molto alta di acetato di potassio come fonte di carbonio (povero). Nonostante diversi tentativi, non è stata osservata alcuna formazione di tetradi. A questo proposito, S. boulardii mostra proprietà simili a RH2585/2586 (il diploide filamentoso usato in questo lavoro) che non forma tetradi al trattamento nelle condizioni descritte. Al fine di indurre la meiosi e la sporulazione, è stato prodotto un doppio knockout di RME1 (Regolatore della Meiosi 1) in S. boulardii. RME1 è un regolatore negativo della meiosi che impedisce l’espressione di proteine richieste per la meiosi come IME1 (induttore della meiosi 1) e promuove la mitosi. Il derivato S. boulardii ∆∆rme1 non ha mostrato alcuna differenza fenotipica rispetto al ceppo parentale wild-type in termini di temperatura di crescita (Figura 1A). Sfortunatamente, non sono state ottenute nemmeno tetradi da questo ceppo knockout. Concludo che S. boulardii non subisce la meiosi e la formazione di tetradi aploidi almeno nelle condizioni di laboratorio qui utilizzate.

Come mostrato nella Figura 1C, S. boulardii non porta alcun marcatore auxotrofico in quanto cresce bene su terreno minimo (SD) privo di aminoacidi o componenti di acido nucleico come adenina o uracile. I geni marcatori auxotrofi potrebbero essere facilmente ottenuti cancellando i geni ADE2 (biosintesi dell’adenina) o HIS3 (biosintesi dell’istidina) (Figura 1C). Queste delezioni sono state ottenute introducendo geni marcatori auxotrofi dominanti che forniscono resistenza agli antibiotici kanamicina/G418 o nourseothricin. La delezione di una singola copia del gene ADE2 o HIS3 ha ancora permesso la crescita su piastre di terreno minimo (non mostrato) indicando il chiaro carattere diploide di questo lievito. Solo la doppia delezione di entrambe le copie del gene HIS3 o ADE2 (che lo ha reso resistente sia alla kanamicina/G418 che alla nourseothricin; Figura 1C) ha reso questo ceppo di lievito auxotrofo per l’istidina o l’adenina. L’auxotrofia dell’istidina appena acquisita è stata utilizzata in un esperimento successivo per trasformarlo con plasmidi di lievito che portano HIS3 come gene marcatore selezionabile (vedi testo successivo).