Questo studio si basa su un sistema di membrane che era caro a K. R. Porter: il reticolo sarcoplasmatico (SR) delle fibre muscolari striate. Porter ha opportunamente battezzato l’abbondante sistema di membrane che circonda strettamente e completamente le miofibrille in tutte le cellule muscolari come SR, in base alla sua posizione (sarcoplasmatica) e alla sua struttura generale come una rete estesa (reticolo). Nelle sue descrizioni del SR, iniziate in collaborazione con H. S. Bennett (1-3), Porter ha riconosciuto due aspetti importanti di questo sistema di membrana. Il primo è che il SR è semplicemente un’espressione specializzata del reticolo endoplasmatico (ER) che pervade tutti i tipi di cellule, e il secondo è che la disposizione precisa del SR in relazione alle miofibrille indica il suo ruolo in qualche aspetto del controllo della contrattilità. Entrambe le intuizioni di Porter sono ora pienamente confermate. È noto che il SR si sviluppa inizialmente come ER contenente la solita varietà di proteine ER generiche e che, man mano che la cellula muscolare si differenzia, si arricchisce notevolmente di proteine SR-specifiche (4, 5). Tre proteine purificate per la prima volta dal SR sono la calcio ATPasi o proteina della pompa del calcio responsabile del pompaggio del calcio nel lume del SR durante il rilassamento (6); la calsequestrina, la proteina legante il calcio a bassa affinità che aumenta notevolmente la capacità del lume del SR per il calcio (7); e il recettore della rianodina (RyR), responsabile del rilascio del calcio durante l’attivazione muscolare (vedi rif 8 per una revisione). In seguito si è scoperto che tutti i tipi di cellule contengono forme e/o analoghi cellula-specifici di queste tre proteine che sono responsabili della gestione del calcio. In tutte le cellule, queste proteine tendono ad essere raggruppate insieme. Il SR è quindi un dominio esteso e specializzato dell’ER delle cellule muscolari. Al contrario, tutte le cellule contengono domini specializzati simili al SR, ma in quantità molto più piccole. Alcune cellule non muscolari, come le cellule di Purkinje del cervelletto, hanno in realtà estesi domini simili al SR che contengono isoforme muscolo-specifiche di RyRs e calsequestrina (9, 10).
Come ha scritto Porter, nel suo stile inimitabile: specifico “la precisa relazione morfologica del reticolo alle miofibrille…. suggerisce che il sistema è funzionalmente importante nella contrazione muscolare”. La comprensione del ruolo specifico del SR nel controllo della contrazione muscolare è stata plasmata da pubblicazioni critiche nel periodo entusiasmante che ha immediatamente preceduto e seguito le descrizioni del SR di Porter. Gli esperimenti di stimolazione locale di A. F. Huxley, eseguiti tra la fine degli anni Cinquanta e l’inizio degli anni Sessanta, indicavano la presenza di una via specifica che permetteva la diffusione dell’evento elettrico all’interno della fibra e quindi fornivano un collegamento cruciale tra la depolarizzazione superficiale e la rapida attivazione delle miofibrille situate al centro (vedi rif. 11 per una revisione). L’articolo seminale del 1959 di A. Weber ha dato la prima prova che gli ioni calcio, ora pienamente riconosciuti come messaggeri intracellulari generali, sono responsabili del controllo della contrazione muscolare (12). S. Ebashi e A. Weber si sono influenzati l’un l’altro attraverso i continenti nella costruzione di prove chiare che la capacità di sequestro del calcio del SR è responsabile del rilassamento, mentre W. Hasselbach ha definito con precisione l’azione di pompaggio del calcio del SR (vedi rif 13 per una revisione).
Avendo seguito da vicino L. D. Peachey nel laboratorio di Porter, ero pienamente consapevole della ricerca, iniziata dai risultati di A. F. Huxely, di un collegamento tra il plasmalemma della fibra muscolare e il suo interno che avrebbe permesso una rapida diffusione dell’evento elettrico all’interno della fibra (14). Nel loro articolo del 1957 (3), Porter e Palade avevano descritto un’unità strutturale ripetitiva, la triade, che si trova in relazione precisa con le bande delle miofibrille: o di fronte alla linea Z o di fronte alla giunzione A-I. La triade è composta da 2 cisterne SR strettamente affacciate su un tubulo centrale. La posizione della triade (3) e del suo tubulo centrale (15-17) coincide con i siti in cui si verifica la diffusione verso l’interno delle contrazioni derivanti dalla depolarizzazione locale (11). Usando accurate sezioni seriali, Andersson-Cedergren (18) ha dimostrato che gli elementi centrali della triade formano una rete continua attraverso le fibre muscolari, da cui il nome di tubuli trasversali (T) per questi componenti della triade. Così gli occhi dei microscopisti elettronici erano puntati sui tubuli T, e io ero pronto per la scoperta che mi accolse verso la fine del mio periodo di formazione post-dottorato nel laboratorio di Porter (1963). Stavo guardando sezioni sottili di muscolo scheletrico di guppy che erano stati allevati nelle vasche di Elisabeth Porter e improvvisamente vidi ripetuti esempi di bocche spalancate di tubuli T sul bordo della fibra. Fu facile ottenere l’attenzione di Porter: Entrai nel suo laboratorio alle 10:00-11:00 PM, la solita fine della sua giornata lavorativa, quando poteva rilassarsi, e gli mostrai i miei negativi. L’interesse di Porter si è subito risvegliato. Le mie immagini non erano alla sua altezza, così prese uno dei miei blocchi, tagliò personalmente delle sezioni sottili, e fece una serie di micrografie, ciascuna un’opera d’arte (Fig. 1A). Le micrografie di Porter costituivano la maggior parte delle illustrazioni nella pubblicazione finale che mostrava che i tubuli T hanno le caratteristiche essenziali necessarie per il loro ruolo nella diffusione della depolarizzazione della membrana superficiale all’interno della fibra (19, vedi anche Fig. 1B). La continuità del lume dei tubuli T con gli spazi extracellulari è stata anche confermata nello stesso anno dalla penetrazione di traccianti dello spazio extracellulare (20, 21) e un colorante fluorescente (22). La continuità dei tubuli T con la membrana superficiale è alla base della grande capacità di membrana superficiale delle fibre muscolari.
I domini funzionali del SR sono associati o alla membrana superficiale o ai tubuli T (Figg. 1C, G), formando con essi giunzioni ben definite chiamate unità di rilascio del calcio (vedi 23, 24 per le recensioni). Durante l’accoppiamento eccitazione-contrazione (e-c), le membrane esterne sono inizialmente depolarizzate, e subito dopo il SR rilascia calcio negli spazi miofibrillari. La questione strutturale diventa quindi: qual è la relazione tra il SR e le membrane esterne in questi siti di giunzione specializzati che permette la traduzione dell’evento elettrico nel rilascio di calcio dal SR durante l’attivazione muscolare? Saltando avanti nel tempo di ∼25 anni, la moderna domanda strutturale riguardante questa fase dell’accoppiamento e-c è: qual è la relazione spaziale tra le proteine del SR e delle membrane esterne nelle unità di rilascio del calcio, e cosa si può dedurre da questa associazione? Quattro proteine del SR giunzionale sono ben identificate: i recettori di rianodina (RyRs), o canali di rilascio del calcio SR (8); la calsequestrina (7, 25); la triadina (26); e la giuntina (27). I RyR sono canali del calcio omotetramerici costituiti da 4 subunità identiche con un grande dominio citoplasmatico e una massa combinata di ∼2.000 kDa, che, quando sono aperti, permettono una rapida fuga del calcio SR negli spazi miofibrillari. I domini citoplasmatici dei RyR sono visibili al microscopio elettronico come piedi che collegano la superficie giunzionale del SR alle membrane esterne (Fig. 1C, D). RyRs sono quindi in posizione strategica per interagire con la membrana di superficie. La calsequestrina è una proteina luminale delle cisterne del SR, situata in prossimità dei domini giunzionali del SR (Figg. 1B, C). La sua funzione è quella di aumentare la capacità totale per il calcio del lume del SR, pur mantenendo una concentrazione relativamente alta di calcio libero, permettendo così un grande gradiente di concentrazione di calcio ionico tra il lume del SR e le miofibrille. La triadina è probabilmente la proteina che collega la calsequestrina alla superficie del SR, mantenendola in prossimità delle RyR, e anche la giuntina può avere un ruolo simile. O una di queste ultime 2 proteine, o altre ancora da identificare, è responsabile di mantenere la calsequestrina immobilizzata in prossimità dei canali di rilascio del calcio. Una proteina di superficie della membrana si trova nei domini giunzionali delle membrane esterne che partecipano alle unità di rilascio del calcio (23): il canale del calcio di tipo L, chiamato anche recettore della diidropiridina (DHPR). I DHPR agiscono come sensori di tensione e come canali del calcio, e la loro azione è necessaria per avviare il rilascio di calcio dal SR (28, 29).
Nel muscolo scheletrico, i DHPR sono raggruppati in tetradi, o gruppi di 4 componenti situati agli angoli di piccoli quadrati (Figg. 1E, I). Le tetradi DHPR formano delle matrici ordinate che fronteggiano le matrici ordinate dei piedi SR in modo tale che ognuna delle 4 DHPR che compongono la tetrade sembra essere legata a una subunità di un piede sottostante (30, 31). Questa relazione strutturale diretta delle 2 principali proteine dell’unità di rilascio del calcio aiuta a sostenere la cosiddetta ipotesi “meccanica” dell’accoppiamento e-c, proponendo che i sensori di tensione nella membrana del tubulo T (successivamente dimostrati essere le DHPR) percepiscano la depolarizzazione e influenzino il rilascio del calcio dal SR tramite un’interazione molecolare diretta (32). Una delle osservazioni strutturali sconcertanti per quanto riguarda la relazione DHPR-RyR è che le tetradi sono associate a piedi alternati (Fig. 1 M), lasciando una serie di piedi orfani (o RyRs) che non sono direttamente collegati a DHPRs. Lavori comparativi su una varietà di muscoli in vivo e in vitro indicano che la disposizione alternata è la regola per il muscolo scheletrico, e non dipende dalla presenza di 2 tipi di isoforme RyR.
La recente esplorazione delle basi molecolari e di sviluppo della relazione DHPR-RyR è il lavoro di due borsisti post-dottorato nel mio laboratorio (Drs. Hiroaki Takekura e Feliciano Protasi) e comporta collaborazioni con i Drs. P. D. Allen, K. G. Beam, B. E. Flucher, e H. Takeshima. La prima domanda che abbiamo considerato è come si produce la disposizione alternata delle tetradi durante lo sviluppo delle giunzioni. Questa domanda è stata esplorata in collaborazione con il Dr. B. E. Flucher usando cellule di origine muscolare scheletrica della linea cellulare BC3H1, che sviluppano cluster co-localizzati di DHPRs, triadina e RyRs alla periferia della cellula (33). Sezioni sottili e liofilizzazione di queste cellule mostrano unità di rilascio del calcio ben differenziate che contengono ampie matrici ordinate di piedi e tetradi. Le tetradi hanno una disposizione alternativa. Molte delle giunzioni hanno tetradi con elementi mancanti, e poiché le troviamo sia nei primi che negli ultimi giorni di coltura, presumiamo che molte rappresentino giunzioni in fase di formazione. È interessante notare che, anche quando sono abbastanza incomplete, le matrici di tetradi hanno la disposizione alternata rispetto alle matrici di piedi, indicando che questa relazione è intrinseca alle interazioni tra le 2 proteine.
La seconda domanda è se il raggruppamento di DHPRs in tetradi è unico per il muscolo scheletrico o è presente in muscoli che sembrano avere una base diversa per l’accoppiamento e-c. Il muscolo cardiaco contiene isoforme di RyRs e DHPRs diverse da quelle del muscolo scheletrico, e differiscono funzionalmente in quanto la permeazione del calcio attraverso i DHPRs sembra essere un requisito per l’e-c coupling (34, 35). DHPRs e RyRs del muscolo cardiaco si trovano in siti che appaiono co-localizzati al microscopio ottico (Fig. 1F), proprio come nel muscolo scheletrico, e questa giustapposizione si ottiene presto nella differenziazione dell’apparato di e-c coupling (36-38). La frattura a freddo, tuttavia, mostra che la disposizione delle DHPRs nel muscolo cardiaco è diversa da quella del muscolo scheletrico (confrontare le Figg. 1I, K). I DHPRs sono in prossimità dei piedi ma non sembrano essere direttamente collegati ad essi (Fig. 1N) in modo che la loro interazione può essere indiretta, attraverso un trasmettitore (ad esempio, il calcio).
Le informazioni di cui sopra sono direttamente rilevanti per la comprensione di 2 modelli di topo per lo studio dell’accoppiamento e-c. In un modello manca la subunità principale (α1) del DHPRs scheletrico. I muscoli non si contraggono a causa di una mancanza di accoppiamento e-c e si sviluppano male (da qui il termine disgenico). Tuttavia, si formano triadi contenenti matrici di piedi, indicando che la presenza di RyRs non è necessaria per la formazione di giunzioni SR-superficie. I cluster di DH-PRs (rilevati tramite immunolabeling) e le tetradi DHPR (rilevate tramite freeze-fracture) mancano nelle cellule muscolari disgeniche, ma sono ripristinate dalla trasfezione di miotubi disgenici coltivati con cDNA per il DHPR, dimostrando che le tetradi sono composte da DHPRs (31, 39, 40). L’altro modello è una mutazione null mirata del RyR di tipo scheletrico, che provoca anche il blocco dell’accoppiamento e-c. Le fibre muscolari prive di RyR, inaspettatamente, formano triadi (41) (Fig. 1H). Le triadi non hanno piedi, da cui il termine dispedico, ma altrimenti appaiono normali in sezioni sottili. Una linea cellulare (1B5) sviluppata da una mutazione dyspedic manca anche l’accoppiamento e-c. Utilizzando queste cellule, abbiamo dimostrato che, nonostante l’assenza di piedi, le giunzioni SR-superficie dyspedic sono formate e contengono triadina e DH-PRs (42). Tuttavia, in freeze-fracture i cluster di DHPRs situato a giunzioni dyspedic non si aggregano in tetradi (Fig. 1L). L’espressione del cDNA che codifica per il muscolo scheletrico di tipo 1 RyR nelle cellule 1B5 si traduce nella formazione di macchie RyR periferiche (Fig. 1P) e nel raggruppamento di DHPR in tetradi (Fig. 1Q). Quindi DHPR non hanno bisogno della presenza di RyRs per raggrupparsi in siti di giunzione SR-superficie, ma hanno bisogno di un’interazione con RyRs scheletrico per formare tetradi. Questo conferma anche indirettamente che un legame tra RyR e DHPRs esiste nelle fibre muscolari scheletriche. Al contrario, la mancanza di tetradi nel muscolo cardiaco indica che un legame RyR-DHPR non è presente o che il legame è diverso da quello del muscolo scheletrico. Sia la presenza del legame RyR-DHPR che la sua assenza o differenza hanno profonde implicazioni funzionali per l’accoppiamento e-c. K. R. Porter avrebbe approvato questi sviluppi nella nostra comprensione del SR, perché sono basati su relazioni struttura-funzione precisamente definibili.