Un microscopio confocale è un tipo di microscopio a fluorescenza 3D in cui la risoluzione è aumentata respingendo la luce fuori fuoco. Questo viene fatto usando dei fori stenopeici con uno specifico raggio stenopeico e lo rende un microscopio 3D intrinseco: a causa della natura di messa a fuoco del microscopio confocale, è particolarmente adatto per ottenere immagini 3D come una raccolta di intensità in diversi punti dello spazio.
Le immagini confocali sono molto adatte alla deconvoluzione Huygens, con l’opzione ottica confocale Huygens, a causa di due ragioni principali:
1. soffrono ancora di sfocatura, che si può vedere chiaramente quando si registrano le immagini delle perle
2. in generale, le immagini confocali sono più rumorose di quelle a campo largo, perché la luce dell’oggetto viene respinta dal foro stenopeico.
Nei microscopi confocali, il tasso di Nyquist è circa la metà di quello dei microscopi a campo largo.
Come funziona un microscopio confocale
I sistemi biologici sono in genere strutture tridimensionali. Quando il campione marcato con fluorofori viene inondato di luce laser di eccitazione come nella microscopia convenzionale a largo campo, l’immagine risultante è solitamente molto disturbata dalla luce fluorescente fuori fuoco. Questo porta alla sfocatura dell’immagine e si traduce in una significativa diminuzione del contrasto. La microscopia confocale è una tecnica per ridurre questa luce fuori fuoco indesiderata. In questa tecnica, la luce di eccitazione è strettamente focalizzata nel campione. La luce di emissione dal fuoco viene raccolta dallo stesso obiettivo, dopo di che viene focalizzata attraverso un piccolo foro stenopeico e diretta verso un fotorilevatore (Figura 1 (a)). La luce di emissione fuori fuoco sarà in gran parte bloccata dal foro stenopeico (Figura 1 (b)). Il risultato di questo metodo è che solo la luce dal volume focale è in grado di raggiungere il rivelatore. Lo svantaggio è che anche la luce proveniente da altre posizioni nel piano focale è bloccata: la microscopia confocale è un’eccitazione puntiforme e una rilevazione puntiforme. Una soluzione è la scansione raster del campione punto per punto per ricostruire un’immagine completa in cui viene raccolto solo il segnale fluorescente dal piano focale. Questa scansione raster può essere ripetuta per diversi piani focali per sezionare campioni spessi e ricostruire un’immagine 3D del campione.
In alternativa, è anche possibile eseguire la scansione del campione con più punti di eccitazione in parallelo come con un microscopio Spinning Disk.
STED è praticamente un’estensione della microscopia confocale point-scanning. Il fascio STED deve essere focalizzato nel campione per ottenere l’alta intensità necessaria per l’emissione stimolata, mentre il rilevamento puntuale riduce la luce fuori fuoco. Per far funzionare STED, il centro del fuoco di eccitazione e l’intensità STED nulla del fuoco a forma di ciambella devono sovrapporsi perfettamente. Un’immagine può quindi essere ottenuta facendo una scansione raster del campione, per esempio con uno stadio di scansione piezoelettrico. La dimensione del pinhole utilizzato determinerà la profondità di fuoco del microscopio.
Deconvoluzione delle immagini confocali
Applicare la deconvoluzione sulle immagini confocali aumenta la loro risoluzione in x, y e z e ripristina dal rumore. Pertanto, le immagini saranno più facili da visualizzare e analizzare. L’algoritmo di default per Confocal è Classic Maximum Likelihood Estimation (CMLE) e il valore SNR di default è 20. Suggeriamo di iniziare con i parametri di default ed esplorare altri valori SNR, per esempio, per ottimizzare i risultati di deconvoluzione. Non dovresti pensare al SNR come un parametro che descrive l’immagine originale, ma come un parametro sintonizzabile che controlla il risultato deconvoluto. Usare un valore di SNR troppo grande potrebbe essere rischioso quando si restaurano originali rumorosi, perché si potrebbe semplicemente migliorare il rumore. Un’immagine confocale rumorosa può avere valori SNR inferiori a 20. Un’altra opzione è provare l’algoritmo Maximum Likelihood Estimation (GMLE) di Good’s roughness per migliorare i risultati. Il GMLE è adatto per immagini rumorose, come quelle confocali o STED.
Prova Huygens gratuitamente sulle tue immagini confocali
Sei il benvenuto a scaricare Huygens tramite la nostra pagina di download e richiedere una licenza di prova con tutte le opzioni.
Remko R.M. Dijkstra, Design and realization of a CW-STED super-resolution microscope setup, Master Thesis , University of Twente, 2012