5 La risposta GC
La ricombinazione della catena pesante dell’immunoglobulina avviene all’interno delle cellule B GC con la trasformazione delle cellule B che producono IgM in cellule B che producono IgG, alterando la funzione effettrice della molecola anticorpale. Questo è rilevante per l’autoimmunità in quanto gli anticorpi IgM che legano i detriti apoptotici e altri ligandi endogeni per i TLR formano immunocomplessi che mediano un effetto immunosoppressivo, in parte, impegnando C1q che poi lega LAIR-1, un recettore inibitorio su monociti e DC (Gronwall, Vas, & Silverman, 2012; Peng, Kowalewski, Kim, & Elkon, 2005; Roos et al., 2004; Son, Santiago-Schwarz, Al-Abed, & Diamond, 2012). Al contrario, gli anticorpi IgG che differiscono dalle loro controparti IgM solo per l’isotipo a catena pesante formano immunocomplessi che possono impegnare i recettori Fc attivanti sulle cellule del lignaggio mieloide e quindi stabilire un milieu proinfiammatorio in cui gli autoantigeni possono essere presentati in modo immunogenico. Mentre le cellule B esprimono solo il recettore Fc inibitorio, FcγRllB, il suo impegno da parte di immunocomplessi IgG, ma non IgM, può aiutare a trasportare ligandi TLR nelle cellule B per avviare programmi di sopravvivenza e attivazione in una cellula che altrimenti potrebbe subire la tolleranza o rimanere quiescente (Green & Marshak-Rothstein, 2011; Herlands, Christensen, Sweet, Hershberg, & Shlomchik, 2008; Pasare & Medzhitov, 2005). Così, gli autoanticorpi IgG possono creare un ciclo di amplificazione una volta che sono fatti che aumenta l’autoreattività. Mentre la ricombinazione del commutatore di classe a catena pesante può essere indotta al di fuori dei GC in assenza di interazione con le cellule T cognate, per esempio, da BAFF, IFNγ, IFN di tipo 1, o IL-21, la ricombinazione del commutatore a catena pesante è uno degli aspetti chiave della risposta dei GC.
Mutazioni puntiformi nei geni della regione variabile delle immunoglobuline (catena pesante più frequentemente della catena leggera) nella risposta GC portano a una seconda ondata di diversificazione del repertorio anticorpale con la conseguente selezione di cellule B con alta affinità per l’antigene elicitante. Sono quelle cellule B che vengono selezionate positivamente all’interno della GC che possono diventare plasmacellule a vita lunga nel midollo osseo o cellule B di memoria (Berek, Berger, Apel, 1991; rivisto in Chan Brink, 2012). I cambiamenti nell’espressione proteica all’interno della cellula B GC facilitano la generazione di cellule B di memoria e di plasmacellule a lunga vita che esprimono anticorpi ad alta affinità commutati per classe. AID è cruciale sia per la ricombinazione del class switch che per l’ipermutazione somatica, i processi chiave della risposta GC (Hase et al., 2008; Muramatsu et al., 2000; Zaheen et al., 2009; Zaheen & Martin, 2011). La generazione di cellule B mature GC è cruciale per l’immunità protettiva. I pazienti privi di AID hanno risposte IgM intatte a bassa affinità, ma non sono in grado di sviluppare la memoria delle cellule B e gli anticorpi ad alta affinità, a catena pesante commutata (Revy et al., 2000). Mentre l’AID può essere espresso in cellule B non GC, e la ricombinazione e l’ipermutazione somatica dell’interruttore di classe a catena pesante si verificano al di fuori dell’ambiente GC, i livelli di espressione e funzione dell’AID sono più alti all’interno del GC (Zaheen & Martin, 2011).
Il ruolo dell’AID nella generazione dell’autoimmunità è complesso. Ci sono prove sostanziali che alti livelli di AID sono associati con l’autoimmunità sia nei topi che nei pazienti con RA in cui le cellule B circolanti esprimono alti livelli di AID (Hsu et al., 2007; Jiang et al., 2007; Xu et al., 2009).Al contrario, la carenza di AID nei topi e nell’uomo è spesso associata all’autoimmunità; se questo si verifica o meno nei topi sembra dipendere dal background genetico (Hase et al., 2008; Quartier et al., 2004). Le GC si formano nei topi con deficit di AID, ma le cellule B GC in questi topi non riescono a subire l’apoptosi (Zaheen et al., 2009). L’autoimmunità dei topi AID-deficienti è stata quindi attribuita a un fallimento della selezione delle cellule B GC dipendente dall’apoptosi.
L’espressione di BBCR è ridotta nelle cellule B GC, e l’espressione di Fas è aumentata (Bras, Martinez, & Baixeras, 1997; Koncz & Hueber, 2012). Questa costellazione di cambiamenti è importante per la maturazione dell’affinità della risposta anticorpale. Il BCR sembra funzionare più per facilitare l’adesione tra la cellula B e altre cellule per migliorare la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule piuttosto che per avviare la segnalazione BCR (Khalil, Cambier, & Shlomchik, 2012). Infatti, il BCR nelle cellule B GC colocalizza con una maggiore abbondanza delle fosfatasi SHP-1 e SHIP-1 (Khalil et al., 2012). L’attivazione delle fosfatasi sull’impegno del BCR impedisce una forte segnalazione del BCR. Inoltre, la diminuita espressione del BCR all’interno delle cellule B GC aumenta la competizione per l’antigene. L’alto livello di espressione di Fas assicura che le cellule B che non sperimentano l’impegno del BCR siano distrutte attraverso un percorso apoptotico (rivisto in Peperzak, Vikstrom, & Tarlinton, 2012). È chiaro che molteplici segnali di rinforzo guidano la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule B antigene-specifiche e sono necessari per tutto il tempo in cui la cellula B si trova nell’ambiente GC.
Con l’accumulo di mutazioni puntiformi nei segmenti del gene dell’immunoglobulina V, si generano anticorpi che hanno maggiore affinità per l’antigene stimolante. Le cellule B con una sufficiente stimolazione iniziale sia dell’antigene che del TFH e del FDC proliferano e vanno incontro a ipermutazione somatica. Le cellule B che hanno subito la mutazione somatica competono tra loro per l’antigene e l’aiuto delle cellule T cognate (Batista & Neuberger, 2000). In questo modo, si verifica una selezione positiva di anticorpi ad alta affinità (rivista in Zotos & Tarlinton, 2012). Quelle cellule B con maggiore affinità per l’antigene hanno maggiori probabilità di diventare plasmacellule piuttosto che cellule di memoria (Smith, Light, Nossal, & Tarlinton, 1997; Smith et al., 2000). È stato ipotizzato che un forte impegno BCR porta alla degradazione di Bcl-6 e la conseguente derepressione di Blimp-1 che porta alla differenziazione delle plasmacellule (Shapiro-Shelef et al., 2003; Shapiro-Shelef, Lin, Savitsky, Liao, & Calame, 2005). Tuttavia, gli anticorpi con minore o nessuna affinità per l’antigene elicitante, e quelli che acquisiscono autoreattività che possono o non possono essere cross-reattivi con l’antigene elicitante, sono anche fatti durante la risposta GC.
Che la mutazione somatica potrebbe portare all’acquisizione di autospecificità è stata dimostrata per la prima volta da noi in studi su una linea cellulare di mieloma del topo. La linea cellulare S107 produce un anticorpo canonico alla fosforilcolina, un epitopo dominante sul polisaccaride della parete cellulare dello pneumococco, che protegge i topi da un’infezione pneumococcica letale. Una sostituzione di una singola base nella regione variabile della catena pesante dell’anticorpo porta ad un anticorpo con un legame marcatamente ridotto alla fosforilcolina ma con una nuova reattività al DNA (Diamond & Scharff, 1984). Questa osservazione ha suggerito per la prima volta che l’autoreattività potrebbe derivare dalla mutazione somatica, in contrasto con l’opinione precedentemente sostenuta che la mutazione somatica è un meccanismo per l’eliminazione dell’autoreattività.
Questa osservazione è stata seguita da studi in vivo nei topi, confermando che le cellule B possono acquisire autoreattività attraverso il processo di mutazione somatica. Abbiamo pensato che le cellule B che acquisiscono l’autoreattività nella risposta GC potrebbero subire di routine l’apoptosi per prevenire l’espressione dell’autoreattività patogena. Abbiamo, quindi, eseguito fusioni di cellule B spleniche dopo l’immunizzazione di topi BALB/c con fosforilcolina accoppiata a un vettore proteico, utilizzando un partner di fusione ingegnerizzato per sovraesprimere Bcl-2 e per prevenire l’apoptosi degli ibridomi formati con cellule B innescate in vivo per andare incontro ad apoptosi (Ray, Putterman, & Diamond, 1996). Circa il 40% degli ibridomi che hanno legato la fosforilcolina hanno mostrato una reattività incrociata al DNA. Questo studio ha dimostrato un’alta frequenza di autoreattività all’interno della risposta GC. Manser e colleghi hanno analogamente dimostrato la reattività anti-DNA che nasce all’interno del GC nella risposta all’aptene fenilarsonato (Alabyev, Rahman, & Manser, 2007).
Queste osservazioni hanno portato a studi di autoanticorpi fatti da pazienti con malattia autoimmune per vedere se la loro autoreattività era codificata all’interno della sequenza della linea germinale o era acquisita da mutazione somatica. Noi e altri abbiamo dimostrato che gli anticorpi anti-DNA mostravano un’alta frequenza di mutazione somatica e che le mutazioni erano responsabili dell’acquisizione dell’autospecificità (Detanico et al, 2012; Jacobi, Hansen, Burmester, Dorner, & Lipsky, 2000; Manheimer-Lory, Zandman-Goddard, Davidson, Aranow, & Diamond, 1997; Mietzner et al, 2008; Schroeder, Herrmann, & Winkler, 2013). Infatti, un recente studio sulle cellule B di memoria nel sangue di individui sani mostra che circa il 15% sono cellule B autoreattive, un numero maggiore rispetto al repertorio delle cellule B ingenue (Mietzner et al., 2008). La selezione positiva del sottogruppo autoreattivo non sembra spiegare l’aumento dell’autoreattività tra il comparto naïve e quello della memoria, poiché almeno la metà delle cellule B autoreattive nella memoria acquisisce la sua reattività attraverso il processo di ipermutazione somatica all’interno del GC. Così, sembrerebbe che l’autoreattività sia generata di routine dall’onda di diversificazione BCR dipendente dal GC.
Un altro studio recente mostra una frequenza inferiore di cellule B autoreattive nel pool di cellule plasmatiche del midollo osseo rispetto al pool di cellule della memoria del sangue (Scheid et al., 2011). Mentre i sottoinsiemi di cellule B studiati non provenivano dagli stessi pazienti, un’implicazione dei dati è che potrebbe esistere un checkpoint di tolleranza prima di diventare una plasmacellula a lunga vita. In alternativa, potrebbe esserci una perdita specifica di cellule B autoreattive all’interno della popolazione di plasmacellule; è possibile che l’impegno del recettore Fc da parte di immunocomplessi contenenti autoantigene porti alla morte selettiva delle plasmacellule autoreattive (Fukuyama, Nimmerjahn, & Ravetch, 2005; Tzeng, Bolland, Inabe, Kurosaki, & Pierce, 2005).