Abstract
Molti pazienti sperimentano un eccellente recupero fisico dopo l’intervento chirurgico; tuttavia, ci sono alcuni di loro che soffrono di fluttuazioni dell’umore, anche di depressione. La depressione postoperatoria può derivare da disfunzioni cognitive, dolore e un sistema immunitario compromesso durante l’intervento. Ma c’è una maggiore possibilità che l’anestesia generale possa essere responsabile dello sviluppo della depressione. Qui, abbiamo impiegato uno degli anestetici più usati, il propofol, in un modello di topo per indagare se questo composto anestetico endovenoso potrebbe causare prestazioni comportamentali simili alla depressione nei topi. Abbiamo trovato che una singola dose di propofol ha causato significative prestazioni comportamentali anormali nella sospensione della coda, nel nuoto forzato e nei test in campo aperto. Abbiamo anche esaminato la sezione del cervello di questi topi e abbiamo rivelato che c’era una significativa espressione ridotta della proteina CD11b, che ha dimostrato un’inibizione del propofol sulla funzione microgliale. Abbiamo studiato l’effetto del propofol sulla proteina sinaptica, SYP, e abbiamo scoperto che non c’era alcuna influenza notevole sull’espressione della proteina. Questi risultati hanno suggerito che il trattamento con propofol potrebbe promuovere i comportamenti di tipo depressivo nei topi attraverso l’influenza della funzione delle cellule microgliali. Inoltre, abbiamo trovato il livello della citochina IL-6 era significativamente aumentato nel tessuto cerebrale, che potrebbe successivamente causare l’attivazione del fattore trascrizionale, STAT3. La nostra scoperta può fornire una nuova prospettiva per comprendere ulteriormente il meccanismo dei farmaci anestetici e decifrare il meccanismo sottostante alla depressione postoperatoria.
1. Introduzione
Molti pazienti che si sottopongono ad anestesia generale o ad un intervento chirurgico sperimentano una qualche forma di depressione post-operatoria, soprattutto durante i sei mesi successivi ad una procedura invasiva. Come una delle frequenti complicazioni dopo l’intervento chirurgico, la depressione può portare a ulteriore morbilità e mortalità, soprattutto per i pazienti anziani. Nel frattempo, i ricercatori hanno scoperto che i pazienti depressi hanno maggiori probabilità di avere altre complicazioni dopo l’intervento chirurgico. Essi sono meno in grado di cooperare bene con i caregiver nella loro cura post-operatoria, come la terapia riabilitativa. Nei pazienti che hanno già una storia di depressione o ansia preesistente, il tempo di recupero dalla depressione post-chirurgica è molto più lungo. Uno studio ha anche suggerito la chirurgia potrebbe esacerbare la gravità della depressione preesistente. Finora, poco si sa sul perché c’è un legame così forte tra chirurgia e depressione. Alcuni ricercatori hanno pensato che la ragione psicologica di per sé è che molte persone sperimentano la depressione post-chirurgica perché le procedure chirurgiche li costringono ad affrontare la propria mortalità. Alcuni studi hanno anche sottolineato i tipi specifici di chirurgia di per sé sull’induzione della depressione post-chirurgica poiché la depressione sembra essere più spesso osservata in alcuni grandi interventi chirurgici, tra cui la chirurgia del cervello, la chirurgia di sostituzione dell’anca e la resezione del cancro. Tuttavia, studi recenti hanno suggerito che la durata del tempo trascorso sotto anestesia sembra essere correlata alla probabilità e alla gravità della depressione. Il Propofol è uno degli anestetici più utilizzati in terapia intensiva dopo un intervento chirurgico. Il trattamento con Propofol è stato trovato significativamente associato a disfunzioni cognitive nel periodo post-operatorio. Finora non è stato fatto alcuno sforzo per esaminare se e come il propofol possa avere un impatto sullo stato d’animo nei pazienti e negli animali. Pertanto, abbiamo impiegato un modello di topo con una singola dose di trattamento con propofol e abbiamo testato i comportamenti di tipo depressivo nel modello di topo. Abbiamo trovato che i topi esposti a una singola dose di trattamento con propofol esercitavano comportamenti simili all’ansia in un test in campo aperto, mostrando meno tempo nell’area centrale e comportamenti simili alla depressione nella sospensione della coda e nei test di nuoto forzato, mostrando un tempo di immobilità più lungo rispetto ai topi di controllo senza iniezione di propofol. I nostri risultati hanno indicato che il propofol potrebbe essere responsabile della fluttuazione dell’umore dopo l’intervento e questo effetto potrebbe essere associato all’influenza del propofol sulle cellule della microglia nel sistema nervoso centrale (SNC).
2. Materiali e metodi
2.1. Animali e trattamento farmacologico
Nel presente studio, abbiamo usato topi maschi C57BL/6 di 8-10 settimane. Tutti i topi avevano libero accesso all’acqua e al cibo. Per tutti gli studi sugli animali, i topi sono stati trattati seguendo rigorosamente le linee guida stabilite dal Chinese Council on Animal Care. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali del Qingdao Municipal Hospital, Shandong, Cina. C’erano due gruppi di topi nello studio: salina normale (controlli; ) e propofol (75 mg/kg; ). Un’iniezione monodose di propofol è stata somministrata ai topi per via intraperitoneale. La soluzione commerciale di iniezione di propofol (Xi’an Libang Pharmaceuticals, Cina) è stata usata qui. La dose di propofol usata qui è adattata dallo studio precedente. Durante il tempo di anestesia, tutti i topi sono stati messi sul pad di riscaldamento per mantenere la loro temperatura corporea. I test comportamentali sono stati eseguiti 1 settimana dopo.
2.2. Campo aperto
Una scatola di legno quadrata è stata utilizzata per il test in campo aperto come precedentemente descritto. All’inizio del test, ogni topo è stato posizionato in un angolo della scatola rivolto verso il muro. La distanza totale percorsa e il tempo totale trascorso nei quadrati interni di tutti i topi sono stati registrati e misurati in una sessione di 5 minuti.
2.3. Test di sospensione della coda
Per il test di sospensione della coda, le procedure sono state eseguite come precedentemente riportato. I topi sono stati sospesi attraverso la coda con un nastro su un piccolo gancio di metallo, e non possono scappare o aggrapparsi alle superfici vicine in questa posizione. Il tempo totale che i topi hanno trascorso immobile durante il periodo di 6 minuti di test è stato registrato. L’immobilità è definita come una mancanza di tentativo dei topi di muovere i loro corpi.
2.4. Test di nuoto forzato
Abbiamo effettuato il test di nuoto forzato come precedentemente riportato. I topi sono stati messi in un bicchiere di vetro riempito d’acqua a temperatura ambiente. Abbiamo testato il tempo totale di immobilità dei topi in una sessione di test di 15 minuti, e gli ultimi 6 minuti sono stati segnati per la durata dell’immobilità. Alla fine di ogni test, i topi bagnati sono stati immediatamente messi in una gabbia con lettiera normale dopo essere stati riscaldati in un asciugamano asciutto.
2.5. Elevated Plus Maze Test
L’elevated plus maze è un metodo semplice per valutare le risposte ansiose degli animali. Abbiamo testato il livello di ansia dei topi utilizzando il test elevated plus maze come precedentemente riportato. Fondamentalmente, l’apparato elevated plus maze è dotato di due braccia aperte e due chiuse ed elevato ad un’altezza di circa 50 cm da terra. All’inizio di ogni test, il topo è stato posizionato nella piazza centrale affrontando il braccio aperto e poi è stato permesso di esplorare le braccia per 5 minuti. La quantità di tempo trascorsa nelle braccia aperte è stata registrata e analizzata da una persona che non era coinvolta nel disegno sperimentale.
2.6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Abbiamo misurato il livello di IL-6 nei tessuti cerebrali utilizzando un kit ELISA commerciale (eBioscience, Thermo Fisher Scientific). Ogni campione è stato analizzato in modo duplicato con diluizioni appropriate in modo che le unità luminescenti relative potessero rientrare nell’intervallo lineare delle curve standard. Il valore di IL-6 di ogni campione è stato normalizzato ed espresso come rapporto rispetto alla proteina di carico totale come rapporto relativo. L’assorbanza di ogni campione è stata misurata con un lettore di micropiastre (Synergy Mx, BioTek, Winooski, VT).
2.7. Western Blot
I campioni cerebrali disciolti sono stati elaborati ed eseguiti su gel SDS-PAGE. Sono stati poi trasferiti su membrane PVDF che sono state bloccate con latte scremato al 5% in tampone TBST. Le membrane bloccate sono state ulteriormente studiate con anticorpi per CD11b (1 : 4000; Abcam, UK), sinaptofisina (SYP), p-Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA), e totale Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA) in latte TBST una notte a 4 ° C. Dopo l’incubazione con gli anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente rispettivamente, le bande di proteine sulla membrana sono state rivelate con la reazione di chemiluminescenza. La β-Actina è stata usata come controllo interno (1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). I risultati quantitativi sono stati espressi come rapporto tra ogni proteina target e la sua β-actina.
2.8. Analisi statistica
I valori presentati nello studio sono stati mostrati come il . La significatività della differenza tra due gruppi è stata determinata dall’analisi del test di Student. Un valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
3.1. Una singola dose di esposizione a Propofol ha causato comportamenti simili alla depressione nei topi con la sospensione della coda e il test di nuoto forzato
In primo luogo, abbiamo testato l’ipotesi se una singola dose di trattamento con propofol potesse causare effetti a lungo termine sulle prestazioni comportamentali nei topi, concentrandosi sul modo della depressione. Abbiamo impiegato i test di sospensione della coda e di nuoto forzato in questi topi per esplorare gli effetti a lungo termine del propofol. Nel test di sospensione della coda, abbiamo trovato che il propofol ha aumentato significativamente il tempo di immobilità rispetto ai topi di controllo senza trattamento con propofol quando i topi erano appesi alla coda (Figura 1). Per confermare ulteriormente i comportamenti simili alla depressione nei topi esposti al propofol, abbiamo usato il metodo del nuoto forzato per misurare il tempo di immobilità di questi topi. I nostri risultati hanno dimostrato che il propofol ha aumentato il tempo totale di immobilità rispetto ai topi del gruppo di controllo (Figura 2). Questi risultati hanno rivelato che una singola dose di trattamento con propofol potrebbe causare e sostenere la performance comportamentale depressiva a lungo termine nei topi.
3.2. Una singola dose di esposizione a Propofol ha causato comportamenti simili all’ansia nei topi con i test in campo aperto e nell’Elevated Plus Maze
L’ansia è la complicazione più frequente nella depressione. Pertanto, abbiamo postulato se il propofol potrebbe indurre comportamenti simili all’ansia in questi topi, basandoci sui risultati comportamentali di cui sopra in questi topi. Abbiamo usato il saggio in campo aperto per testare il livello di ansia di questi topi. Come mostrato nella Figura 3(a), il trattamento con propofol ha ridotto efficacemente il tempo totale trascorso dai topi sull’area centrale in campo aperto. E abbiamo anche misurato un altro importante parametro del test, la distanza totale di viaggio dei topi. Come ci aspettavamo, l’iniezione di propofol ha diminuito significativamente la distanza di viaggio dei topi nella sessione di test di 5 minuti rispetto ai topi di controllo (Figura 3(b)). Successivamente, abbiamo studiato i comportamenti ansiosi di questi topi nel test del labirinto elevato più. Abbiamo scoperto che i topi esposti al propofol hanno mostrato un tempo significativamente inferiore speso in braccia aperte (Figura 4), che era in linea con i risultati del test in campo aperto.
(a)(a)
(b)(b)
(a)
3.3. Una singola dose di esposizione a Propofol ha causato l’aumento del livello di IL-6 nei tessuti cerebrali dei topi
Uno studio recente ha suggerito il coinvolgimento della neuroinfiammazione nei deficit cognitivi post-operatori simili al delirio. Abbiamo testato se il propofol potesse avere un impatto sul livello di espressione di IL-6 nei tessuti cerebrali di questi topi. Per arrivare a questa conclusione, abbiamo eseguito un test ELISA nei tessuti cerebrali (ippocampo e corteccia) per valutare il livello di IL-6 nei topi con o senza trattamento con propofol. I nostri risultati hanno dimostrato che il trattamento con propofol in questa condizione potrebbe essere in grado di upregolare il livello di espressione di questa citochina nel cervello dei topi esposti a propofol (Figura 5). Questo risultato ha indicato che il propofol potrebbe causare comportamenti simili all’ansia e alla depressione nei topi influenzando la risposta infiammatoria nel loro cervello.
3.4. Una singola dose di esposizione a Propofol ha causato la riduzione dell’espressione di CD11b e l’aumento dell’espressione di p-STAT-3 nei tessuti cerebrali dei topi
Infine, abbiamo sondato i possibili meccanismi cellulari e molecolari che potrebbero essere responsabili dei cambiamenti comportamentali in questi topi esposti a propofol. Abbiamo testato se le cellule gliali sono state influenzate dal trattamento con propofol osservando la proteina creatrice microgliale, CD11b. Con uno studio western blot, abbiamo trovato che il livello di espressione di CD11b era ridotto nel cervello dei topi con trattamento con propofol (Figura 6(a)), il che ha suggerito che la funzione microgliale potrebbe essere regolata dal trattamento con propofol. Nel frattempo, l’espressione della proteina presinaptica SYP non è stata influenzata dal trattamento con propofol (Figura 6(c)). Abbiamo anche studiato la funzione del fattore trascrizionale STAT-3 indagando lo stato di fosforilazione di STAT-3 (p-STAT-3). I nostri risultati di western blot hanno dimostrato che il trattamento con propofol ha causato l’aumento del livello di espressione di p-STAT-3 senza influenzare l’espressione di STAT-3 totale (Figura 6(b)). Questi risultati implicano che il propofol potrebbe influenzare la funzione delle cellule microgliali e aumentare la fosforilazione di STAT-3 mentre induce l’ansia e la depressione come prestazioni comportamentali nei topi.
(a)(a)
(b)
(c)(c)
(a)
(b)
(c)
4. Discussione
Le disfunzioni cognitive e di memoria sono state abbastanza studiate, ma la fluttuazione dell’umore post-operatorio non ha attirato abbastanza attenzione finora. Alcune evidenze hanno sostenuto l’idea che ci sono stati cambiamenti significativi dell’umore che si sono verificati nei pazienti che sono esposti alla chirurgia e al trattamento anestetico. Qui, abbiamo testato una nuova ipotesi che il trattamento anestetico di per sé può essere sufficiente a influenzare significativamente lo stato d’animo negli animali che sono stati sottoposti a una singola dose di trattamento anestetico senza una procedura chirurgica di accompagnamento. Abbiamo usato il propofol come composto anestetico rappresentativo e lo abbiamo iniettato intraperitonealmente nei topi. Nei giorni seguenti, una serie di comportamenti depressivi e di ansia sono stati eseguiti per osservare i cambiamenti di umore nei topi. Abbiamo scoperto che c’erano differenze significative sulle prestazioni comportamentali tra questi topi con o senza esposizione al propofol. Poiché questi effetti indotti da propofol sono stati sostenuti per un tempo significativo anche dopo che il farmaco è stato tolto, abbiamo postulato che questi effetti non erano l’influenza acuta dell’anestetico ma erano mediati da altri sistemi nel SNC. Qui, abbiamo chiesto se una cellula microgliale è stata attivata nel cervello dei topi dopo l’esposizione al propofol. Il marcatore proteico delle cellule microgliali, CD11b che è una delle proteine marcatrici comuni per dimostrare l’attivazione della microglia, è stato studiato con western blot. Sorprendentemente, i nostri risultati hanno indicato che il propofol potrebbe inibire il livello proteico di CD11b. La spiegazione plausibile qui è che il propofol potrebbe inibire l’espressione della proteina CD11b indipendentemente dal fatto che le cellule microgliali fossero attivate o meno. L’avanzamento prominente del propofol può essere importante per il trattamento potenziale di alleviare l’iperattivazione microgliale in alcune condizioni patologiche del SNC, come il trauma, l’ictus e la sclerosi multipla. Abbiamo anche esaminato l’effetto del propofol sulle proteine sinaptiche che sono fattori fondamentali molto importanti dietro le prestazioni comportamentali degli animali. È interessante notare che anche se il propofol potrebbe influenzare la funzione delle cellule microgliali, non sembra avere un impatto sul livello di espressione delle proteine sinaptiche. Questi risultati non sono in linea con alcune relazioni precedenti. La possibile ragione può essere dovuta alla differenza della finestra temporale in cui le proteine sono state raccolte dopo la somministrazione del propofol. Ma i nostri risultati hanno ancora suggerito che il propofol potrebbe avere un impatto diverso sul neurone e altre cellule gliali. Nello studio futuro, gli effetti del propofol sulle cellule gliali e neuronali dovrebbero essere elaborati individualmente.
La risposta neuroinfiammatoria nel SNC esposto alla singola dose di propofol è stata ulteriormente convalidata dal test ELISA di IL-6 in questi due gruppi di topi. Abbiamo trovato che il trattamento con propofol potrebbe indurre un upregulation di IL-6 nel cervello del topo. Questi risultati erano in linea con i risultati del propofol sulla funzione delle cellule microgliali. Mentre inibisce la componente CD11b, il propofol può attivare le vie di segnalazione rilevanti che sono importanti per l’attivazione delle cellule microgliali.
Collettivamente, il nostro studio ha suggerito che il propofol era in grado di influenzare la funzione delle cellule microgliali ed esacerbare la risposta infiammatoria nel SNC. La reazione cellulare e molecolare potrebbe essere responsabile dei cambiamenti comportamentali in questi topi a cui è stata somministrata una singola dose di propofol. Il nostro studio ha sottolineato il ruolo importante degli anestetici sull’impatto dei cambiamenti di umore dopo l’operazione, ma l’umore potrebbe essere significativamente influenzato da molti fattori, tra cui l’infiammazione che è molto spesso visto nei pazienti durante e dopo l’intervento. Pertanto, una serie di studi ben progettati e sistematici su un modello animale che coinvolga non solo gli anestetici ma anche la procedura chirurgica è garantita per il futuro.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Riconoscimenti
Gli autori ringraziano il supporto finanziario del Dipartimento di Ortopedia, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao, Shandong, Cina, e il supporto tecnico della Weifang Medical University, Weifang, Cina.