Tutte le corsie: anticorpo beta Actin – controllo di carico (ab8227) alla diluizione 1/5000
Lane 1: estratto di cellule intere HeLa
Lane 2: Estratto di cellule di lievito
Lane 3: Lisato di tessuto cerebrale di topo
- Vedi la nostra lista di lisati di controllo positivo disponibili, peptidi bloccanti e proteine di controllo positivo.
- Vedi gli anticorpi secondari AbExcel per western blot eccezionali.
- Guarda i nostri protocolli video facili da seguire.
I protocolli sono forniti da Abcam “AS-IS” basati sulla sperimentazione nei laboratori Abcam utilizzando reagenti e prodotti Abcam; i risultati ottenuti utilizzando protocolli al di fuori di queste condizioni possono variare.
Trascrizione del webinar
Lo scopo del western blotting è di separare le proteine su un gel in base al peso molecolare. Le proteine sono poi trasferite su una membrana dove possono essere rilevate usando anticorpi. Riscaldare i campioni e 95 gradi C per 5-10 minuti in un tampone campione contenente un agente riducente come il beta-mercaptoetanolo. Questo si traduce in proteine linearizzate con una carica negativa proporzionale alla loro dimensione.
Porre un gel nella vasca di elettroforesi e aggiungere il buffer, assicurandosi che la parte superiore dei pozzetti sia coperta. La percentuale di acrilamide del gel utilizzato dipende dal peso molecolare della proteina bersaglio. Nodificare un mercato di peso molecolare nella prima corsia, quindi caricare i campioni nei pozzetti adiacenti. Tutti i campioni che contenevano quantità uguali di proteine. Una volta che tutti i campioni sono caricati, aggiungere il tampone di esecuzione, posizionare il coperchio sulla vasca di elettroforesi. Accendere l’alimentazione e impostare la tensione raccomandata dal produttore dei gel nel serbatoio del gel. Si dovrebbe essere in grado di vedere le bolle che salgono attraverso il serbatoio. Esegui il gel fino a quando il fronte della matrice si è spostato sufficientemente lungo il gel.
La fase successiva è quella di trasferire le proteine dal gel su una membrana. Le membrane sono solitamente fatte di nitrocellulosa o PVDF. Rimuovi il gel dalla vasca e liberalo attentamente dalla sua custodia di plastica. Tagliare i pozzetti e il piede del gel e mettere il gel nel tampone di trasferimento. Preparare la pila di trasferimento inserendo la membrana e il gel tra carta da filtro e spugne. La membrana dovrebbe essere tracciata all’elettrodo positivo e il gel più vicino all’elettrodo negativo. Utilizzare un piccolo rullo per rimuovere eventuali bolle tra il gel e la membrana. Tappare il contenitore di trasferimento chiuso e immergerlo in un serbatoio di trasferimento contenente il buffer di trasferimento. Aggiungere acqua alla camera esterna per mantenere il sistema fresco e mettere il coperchio. Accendere l’alimentazione per iniziare il trasferimento delle proteine. Tempo e tensione richiedono l’ottimizzazione, quindi controllare le istruzioni del produttore per la guida.
Ora che le proteine sono migrate dal gel sulla membrana di nitrocellulosa, la proteina di interesse può essere rilevata come anticorpo. La membrana può essere rimossa dalla cassetta e il mercato del peso molecolare dovrebbe ora essere visibile. Se necessario, il trasferimento delle proteine può essere confermato colorando la membrana con una soluzione. Per prevenire il legame aspecifico dell’anticorpo, la membrana deve essere bloccata. Versare il tampone di bloccaggio sulla membrana e agitare delicatamente su un bilanciere. Tipicamente, questo viene fatto usando una soluzione di latte al cinque per cento o sieroalbumina bovina, BSA, per due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi. Il tempo e il tipo di tampone di blocco dovrebbe essere ottimizzato, quindi controllare la scheda tecnica dell’anticorpo primario che si intende utilizzare per i dettagli.
Dopo che la membrana è bloccata, rimuovere il tampone di blocco e aggiungere l’anticorpo primario diluito nella stessa soluzione. Incubare sul bilanciere come prima. Tipicamente le incubazioni dell’anticorpo primario sono per un’ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi C. La concentrazione dell’anticorpo e il tempo di incubazione dovranno essere ottimizzati. Fare riferimento alla scheda tecnica dell’anticorpo per una guida. Versare l’anticorpo primario e risciacquare la membrana due volte nel tampone di lavaggio. Seguire con un lavaggio di 15 minuti e tre lavaggi di 10 minuti su un bilanciere. Il tampone di lavaggio è solitamente Trys buffered saline, TBS, o phosphate buffered, saline, PBS, con 0.1 per cento tween 20.
Vuotare il tampone di lavaggio e incubare la membrana in anticorpo secondario coniugante che è stato diluito in tampone di bloccaggio. Di solito questo viene fatto per un’ora a temperatura ambiente, ma la concentrazione dell’anticorpo e il tempo di incubazione dovranno essere ottimizzati. Togliere l’anticorpo secondario e lavare la membrana come mostrato in precedenza. Se gli anticorpi secondari si coniugano in un enzima, incubare la membrana nel substrato appropriato prima dell’imaging. Se gli anticorpi secondari sono coniugati con fluorescenza, allora si può passare direttamente alla fase di imaging. L’imaging può essere effettuato con una pellicola a raggi X o con un sistema di imaging digitale. Posizionare la membrana in un vassoio di imaging. Posizionare il vassoio di imaging nel sistema di imaging. I tempi di esposizione dovranno probabilmente essere ottimizzati per rilevare chiaramente le bande relative alle proteine di interesse.