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Risultati

Struttura complessiva della proteina Ivy di E. coli

La proteina codificata dal gene ykfE è stata espressa e purificata nel contesto di un progetto di genomica strutturale che mirava sistematicamente ai geni di E. coli dalla funzione sconosciuta. La proteina YkfE è stata trovata serendipitosamente a copurificare, e poi a cocristallizzare con HEWL utilizzato nel protocollo di routine di distruzione batterica. La proteina YkfE è stata successivamente caratterizzata come un potente e specifico inibitore del lisozima di tipo C (7), e il nome del gene è stato cambiato in Ivy (inibitore del lisozima vertebrato) per riflettere questa proprietà. Strutture cristalline ad alta risoluzione sono state ottenute per l’Edera di E. coli (Ivyc) sia in isolamento che in complesso con il lisozima.

Descrizione della struttura

Abbiamo precedentemente dimostrato con studi di filtrazione su gel e fluorescenza che l’omodimero periplasmatico di Ivyc è l’unità fisiologicamente attiva, con una dimerizzazione K d nell’intervallo 10-9 M (7). La proteina Ivyc si è cristallizzata come dimero. L’unità asimmetrica del cristallo contiene tre molecole corrispondenti a un dimero non cristallografico e a un monomero. Applicando la simmetria cristallografica, questo monomero ricostruisce il dimero fisiologico. Ogni monomero consiste in un foglio β centrale formato da cinque filamenti β antiparalleli fiancheggiati sul lato convesso da due brevi eliche (α1, α2; rispettivamente sei e otto residui) e, sul lato concavo, da un’elica anfipatica (α4; 11 residui) (Fig. 1). Abbiamo cercato omologhi strutturali di questo dominio usando il programma DALI (8). La migliore corrispondenza strutturale nel PDB è l’istone acetiltransferasi 306-aa (codice PDB 1BOB) dal lievito (Z = 5.2), con solo il 9% di residui identici su 89 aminoacidi e un rmsd di 4.0 Å. Tuttavia, la topologia delle due strutture è marcatamente diversa, rendendo così la struttura Ivy una piega nuova. La struttura del dimero mostra una piega a ferro di cavallo centrata sulle due eliche anfipatiche antiparallele (α4) (Fig. 1 b). Nel cristallo, c’è 1.605-Å2 superficie sepolta tra i due monomeri legati dall’asse cristallografico 2-fold (monomero A) e 1.432-Å2 superficie sepolta tra i due monomeri legati dall’asse non cristallografico 2-fold (monomeri B e C). L’rmsd tra i tre monomeri varia da 0,547 Å (B/C) a 0,865 Å su 122 residui (A/B) in base alla sovrapposizione Cα. La struttura rivela che il dimero coinvolge interazioni tra dorsali e catene laterali di residui tutti riuniti nella parte C-terminale della molecola nel filamento β6 e nelle eliche α4 e α5 (Fig. 2 b). Questi residui sono conservati in vari ceppi di E. coli, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, e sequenze di omologhi di Burkholderia cepacia, suggerendo che la proteina Ivy è un dimero funzionale in questi batteri e probabilmente monomerico negli altri batteri contenenti Ivy.

Meccanismo di inibizione del lisozima: The Ivyc-HEWL Complex Structure (PDB Code 1GPQ).

L’unità asimmetrica del cristallo contiene un omodimero non cristallografico di Ivyc in complesso con due molecole di HEWL. Ci sono due tipi di interazioni Ivyc/HEWL: l’interazione principale che coinvolge una superficie sepolta di 969-Å2 tra un monomero Ivyc e una molecola HEWL, e un’interazione secondaria che coinvolge una superficie sepolta di 552-Å2 tra il secondo monomero Ivyc e la stessa molecola HEWL, creando così una superficie sepolta di 1.340-Å2 tra l’omodimero Ivyc e la prima molecola HEWL (Fig. 2 a). Per il secondo monomero HEWL, la superficie sepolta è di 1.043 Å2 per l’interazione principale e di 623 Å2 per l’interazione secondaria, per un totale di 1.361-Å2 di superficie sepolta tra l’omodimero Ivyc e la seconda molecola HEWL.

La struttura del complesso conferma la stoeciometria sperimentale dell’interazione tra Ivyc e HEWL (7) e suggerisce immediatamente il meccanismo di inibizione del lisozima da parte della molecola Ivyc. Attraverso la formazione del complesso Ivyc/HEWL, il sito attivo del lisozima viene occluso da un anello che sporge dalla molecola Ivyc (Fig. 2 c e d). Al centro di questo anello, un residuo di istidina (H60) crea legami a idrogeno con due dei tre residui responsabili dell’attività enzimatica del lisozima (D52 e E35). La molecola di lisozima complessata con Ivyc non mostra alcun cambiamento strutturale significativo (rmsd ≈0,5 Å su 127 residui basato sulla sovrapposizione Cα di 1HEL con le molecole di lisozima nel cristallo). Tuttavia, una molecola d’acqua è esclusa dal sito attivo del lisozima e sostituita dall’istidina del loop inibitorio di Ivyc.

Il confronto delle strutture raffinate di Ivyc in isolamento o complessato con HEWL (Fig. 2 b e Tabella 2) rivela alcuni cambiamenti conformazionali minori. Questi includono l’orientamento della piccola elica (α3) nei tre monomeri della forma libera di Ivyc. L’orientamento osservato nella molecola A è il più vicino a quello osservato nel dimero Ivyc complessato con HEWL. Tre 310-elici (η1, η2, e η3) visti nella struttura Ivyc/HEWL sono assenti nelle tre molecole di Ivyc non complessate. Più sorprendentemente, il loop sporgente di Ivy che interagisce direttamente con il sito attivo del lisozima non mostra un notevole cambiamento conformazionale tra le due forme cristalline. La rigidità di questo loop piuttosto corto può essere spiegata dalla presenza di un legame disolfuro (C57-C62) e di un ponte salino tra il residuo di lisina (K58) accanto alla prima cisteina e il residuo di aspartato (D61) accanto alla seconda cisteina. Questi vincoli strutturali che suggeriscono un’interazione di tipo key-lock con i lisozimi di tipo C potrebbero spiegare la stretta conservazione della sequenza di loop tra un sottoinsieme di omologhi Ivy (ortologhi Ivyc) anche in batteri lontanamente correlati (Fig. 3 e SI Fig. 5).

Studi funzionali: Caratterizzazione di mutanti di E. coli ΔIvy.

Il ruolo centrale del ciclo CKPHDC nell’inibizione è stato convalidato sperimentalmente dalla mutagenesi diretta. Sono state eseguite sostituzioni di aminoacidi per valutare l’influenza di alcuni dei residui chiave di interazione come suggerito dalla struttura del complesso Ivyc/HEWL. Come previsto, abbiamo osservato una minore attività inibitoria per i mutanti di istidina (H60). L’effetto più drastico (aumento di 300 volte di K i) è stato osservato quando si è introdotto un residuo aspartico caricato negativamente in questa posizione (Tabella 3). Questo effetto è molto probabilmente causato da un’interazione repulsiva con i due residui acidi del sito attivo del lisozima (D52 e E35). D’altra parte, nessun cambiamento significativo nell’attività inibitoria è stato osservato introducendo una mutazione C62 → A62 che interrompe il ponte disolfuro.

Abbiamo eseguito un knockout del gene ivy dell’E. coli per valutare l’effetto protettivo in vivo della proteina Ivy in presenza di lisozima. Il solo knockout del gene ivy in E. coli non ha mostrato un fenotipo di maggiore sensibilità all’HEWL, confermando così che, in condizioni di laboratorio, il lisozima non penetra la parete batterica (9). Abbiamo quindi costruito un doppio mutante introducendo una delezione TolB-pal per riprodurre il fenotipo “parete cellulare porosa” descritto in precedenza (10). È stato precedentemente dimostrato che i mutanti di E. coli ΔtolB mostrano un tipico fenotipo di sensibilità ai farmaci e ai detergenti, perdite e formazione di vescicole della membrana esterna (10, 11), a causa di un’alterata sintesi dell’involucro. Abbiamo misurato la sensibilità al lisozima del doppio mutante ΔtolBΔivy con riferimento al mutante ΔtolB (JC864). In condizioni di laboratorio, il mutante ΔtolB è risultato sensibile a concentrazioni di lisozima superiori a quelle trovate nelle secrezioni (>50 μg-ml-1; SI Fig. 6), dimostrando così che le molecole di dimensioni proteiche, oltre alle piccole molecole, possono penetrare tali cellule di E. coli con perdite. Il mutante ΔtolBΔivy è stato poi testato ed è stato trovato a mostrare una maggiore sensibilità a HEWL perché per concentrazioni fisiologiche (50 μg-ml-1; Fig. 4 a) l’effetto del lisozima sulla crescita batterica era già visibile, sostenendo il ruolo protettivo di Ivyc. Questo effetto protettivo è stato ulteriormente confermato dalla sovraespressione di Ivyc in un doppio mutante ΔtolBΔivy che porta un plasmide di espressione isopropilico β-d-tiogalattoside-inducibile (Fig. 4 b) dove l’espressione di Ivy era in grado di ripristinare la crescita batterica per concentrazioni di lisozima fino a 500 μg-ml-1. Risultati simili sono stati descritti anche nel contesto di altri trattamenti permeabilizzanti (9).

La famiglia delle proteine Ivyc: Distribuzione filogenetica.

Una ricerca esaustiva per gli omologhi della proteina Ivy di E. coli è stata eseguita utilizzando tutti i dati di sequenza pubblicamente accessibili, comprese le sequenze complete del genoma batterico e i dati dei progetti di sequenziamento in corso di tutti i principali centri di sequenziamento del genoma (vedi Materiali e metodi). Tutte le sequenze identificate dell’omologo di Ivy sono state utilizzate iterativamente come query per ottimizzare il rilevamento di parenti più distanti dal punto di vista evolutivo. Sono state identificate un totale di 35 distinte sequenze simili a Ivy (che vanno dal 100% al <25% di identità di sequenza con la proteina Ivy di E. coli K12). Sorprendentemente, gli omologhi di Ivy sono stati identificati solo in membri dei Proteobatteri (batteri Gram-negativi), e tutti sono previsti essere periplasmatici (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Da un lato, può sembrare logico che le proteine Ivy si colocalizzino con la parte di proteoglicano (il substrato del lisozima) all’interno del compartimento periplasmatico. D’altra parte, si pensa che la rete di proteoglicani sia fisicamente protetta dall’attacco di enzimi esogeni dalla parete cellulare dei Proteobatteri e non è considerata un substrato naturale per il lisozima. La presenza di un gene che codifica un inibitore del lisozima in batteri Gram-negativi piuttosto che Gram-positivi è quindi un paradosso. L’albero filogenetico degli omologhi dell’Edera è presentato in Fig. 3, secondo le divisioni standard dei Proteobatteri (12): alfa, beta, gamma, delta ed epsilon. Ad oggi, la famiglia delle proteine Ivy è maggiormente rappresentata nelle divisioni gamma e beta, ma due omologhi Ivy sono stati identificati inequivocabilmente in due specie non correlate della divisione alfa: Parococcus denitrificans e Gluconobacter oxydans. All’interno delle divisioni gamma e beta, gli omologhi di Ivy sono sporadicamente distribuiti. Per esempio, gli omologhi di Edera sono presenti in tutte le Enterobacteriales, tranne che in Salmonella, ma si trovano anche in tutte le Pseudomonadaceae sequenziate. Allo stesso modo nella divisione beta, gli omologhi di Ivy si trovano in tutte le Burkholderia, sono identificati in una sola specie di Neisseriaceae, e sono assenti da molti altri genomi sequenziati di questa divisione. Una distribuzione così sporadica della famiglia di proteine Ivy denota una complessa storia evolutiva sottostante fatta di perdite geniche differenziali attraverso i cladi sovrapposte ad eventi di trasferimenti orizzontali come suggerito dall’analisi filogenetica dettagliata (Fig. 3). Ad eccezione degli alfaproteobatteri, la maggior parte delle specie che ospitano gli omologhi di Ivyc sono patogeni o patogeni opportunistici per l’uomo o altri vertebrati.

Otologhi di Ivy vs. Paraloghi.

La maggior parte dei membri identificati della famiglia delle proteine Ivy, compresi gli omologhi più vicini a E. coli Ivy, mostrano una conservazione assoluta della sottosequenza CKPHDC (SI Fig. 5a). Questo motivo coincide esattamente con il ciclo inibitorio del lisozima identificato nella struttura 3D del complesso HEWL/Ivyc e nei nostri studi funzionali sui mutanti del ciclo Ivyc (vedi sopra). Sulla base di questi dati, abbiamo classificato gli omologhi di Ivy che esibiscono questa sequenza di loop come ortologhi in buona fede del gene Ivy dell’E. coli (cioè, previsti per essere inibitori del lisozima e svolgere la stessa funzione nelle loro rispettive specie). Due ulteriori sequenze ortologhe contengono una conservazione quasi esatta del loop, con il residuo di aspartato sostituito da un residuo di asparagina nella sequenza di Burkordelia cepacia Ivy (48% di identità con Ivyc) e il residuo di lisina sostituito da un residuo di arginina nella sequenza Gluconobacter oxydans 621H Ivy (26% di identità con Ivyc). Le analisi di queste mutazioni nel contesto della struttura 3D del complesso Ivyc/HEWL suggeriscono che entrambe dovrebbero essere compatibili con una corretta interazione lisozima/Ivy e quindi con l’inibizione del lisozima. I cinque rimanenti omologhi di Ivy che presentano sequenze di loop non canoniche sono stati definiti paraloghi di Ivy dell’E. coli (ovvero, si prevede che svolgano funzioni diverse) (SI Fig. 5b). I paraloghi Ivy si trovano solo nelle specie del genere Pseudomonas: P. aeruginosa, P. syringae, P. putida e P. fluorescens, tutte con sequenze di loop CExxDxC correlate, ma diverse. Inoltre, P. aeruginosa è l’unica specie che presenta sia una versione ortologa che una paraloga di Ivy. La sequenza ortogonale di P. aeruginosa Ivy è anche la più simile alla sequenza paraloga di P. aeruginosa Ivy, suggerendo fortemente che una duplicazione genica che porta al ciclo non canonico nei paraloghi di Ivy è avvenuta lungo il ramo che porta alle Pseudomonadaceae. L’assenza di omologhi di Edera nel vicino genere Acinetobacter potrebbe essere causata da successive perdite di geni.

Espressione e caratterizzazione funzionale degli omologhi di Edera di P. aeruginosa.

Per testare le nostre previsioni funzionali sulle forme di Edera ortologhe rispetto a quelle paraloghe, abbiamo espresso (vedi Materiali e metodi) il prodotto di entrambi i geni legati a Edera di P. aeruginosa. Le due proteine chiamate Ivyp1 (ortologo) e Ivyp2 (paralogo) sono state purificate e testate per la loro attività inibitoria contro HEWL. Come previsto dalle rispettive sequenze di loop, la proteina Ivyp1 (CKPHDC) è risultata inibire l’attività del lisozima, mentre Ivyp2 (CEKSDC) no. Il risultato dell’inibizione di Ivyp1 dell’attività HEWL è presentato in SI Fig. 7a . Come per Ivyc, l’inibizione segue un meccanismo di “legame stretto lento” con un Kiapp {Ivyp1, HEWL} di ≈25 nM.

Struttura di P. aeruginosa Ivyp1 (PDB Code 1UUZ).

Dopo la dimostrazione che P. aeruginosa Ivyp1 e E. coli Ivy presentavano attività antilisozima simili, abbiamo determinato la struttura del complesso Ivyp1:HEWL per visualizzare come l’interazione inibitoria fosse preservata nonostante la remota somiglianza di queste due sequenze proteiche Ivy (30% di residui identici; SI Fig. 5a ). Come previsto, la struttura di Ivyp1 è simile alla struttura del monomero Ivyc. Tuttavia, come previsto dalla non conservazione dei residui coinvolti nella formazione dei dimeri di Ivyc, P. aeruginosa Ivyp1 è un monomero.

Nonostante questa differenza significativa, l’interazione dei due omologhi di Ivy con la molecola di lisozima è notevolmente simile (Fig. 2, SI Fig. 7b , e SI Tabella 4). Il Cα rmsd tra i monomeri Ivyp1 e Ivyc è ≈2.8 Å. Abbiamo quindi confrontato le superfici di interazione nei due complessi per identificare i residui chiave responsabili della robustezza dell’interazione Ivy-lisozima. In entrambi i complessi Ivy, l’interazione Ivy-HEWL coinvolge la stessa quantità di ponti salini, legami idrogeno che coinvolgono catene laterali, catene laterali/catene principali, e interazioni con la catena principale. Tuttavia, tra i numerosi residui coinvolti nell’interazione con il lisozima, solo tre sono strettamente conservati: il residuo di istidina (H60 in Ivyc, H62 in Ivyp1) che forma sia un legame idrogeno diretto (E35-OE1) che un legame idrogeno indiretto attraverso una molecola d’acqua (D52-OD1) all’interno del sito attivo HEWL, un residuo di aspartato (D61 in Ivyc e D63 in Ivyp1), e un residuo di glutammato (E120 in Ivyc e E123 in Ivyp1). Abbiamo poi confrontato le aree di interazione nei due complessi. A causa dello stato dimerico della molecola Ivyc, l’area di superficie sepolta alla formazione del complesso Ivyc-HEWL è più grande (≈1,340 Å2) che per il complesso Ivyp-HEWL (≈1,000 Å2). Questa differenza spiega probabilmente la minore attività inibitoria (25 volte inferiore) di Ivyp1 rispetto a Ivyc.