Come funziona la tecnica
La microscopia a contrasto di fase traduce piccoli cambiamenti di fase in cambiamenti di ampiezza (luminosità), che sono poi visti come differenze nel contrasto dell’immagine.
I campioni non colorati che non assorbono la luce sono conosciuti come oggetti di fase. Questo perché cambiano leggermente la fase della luce che viene diffratta da loro; la luce è solitamente sfasata di circa ¼ di lunghezza d’onda rispetto alla luce di fondo. I nostri occhi non sono in grado di rilevare queste lievi differenze di fase perché possono rilevare solo le variazioni di frequenza e di intensità della luce.
Il contrasto di fase permette di produrre immagini ad alto contrasto aumentando ulteriormente la differenza di fase della luce. È questa caratteristica che permette di separare la luce di fondo dalla luce diffratta del campione. La differenza di fase della luce viene aumentata rallentando (o facendo avanzare) la luce di fondo di una lunghezza d’onda di ¼, con una piastra di fase appena prima del piano dell’immagine. Quando la luce è focalizzata sul piano dell’immagine, la luce diffratta e la luce di fondo causano un’interferenza distruttiva (o costruttiva) che diminuisce (o aumenta) la luminosità delle aree che contengono il campione, rispetto alla luce di fondo.
La luce proveniente da una lampada alogena al tungsteno passa attraverso l’anello del condensatore nel condensatore di sottostage prima di raggiungere il campione. Questo permette al campione di essere illuminato da una luce parallela che è stata defocalizzata.
Una parte della luce che passa attraverso il campione non sarà diffratta (giallo brillante nell’immagine). Queste onde luminose formano un’immagine luminosa sull’apertura posteriore dell’obiettivo. Le onde luminose che sono diffratte dal campione passano il piano diffratto e si concentrano solo sul piano dell’immagine. Questo permette di separare la luce di fondo e la luce diffratta.
La piastra di fase cambia quindi la velocità della luce di fondo di ¼ di lunghezza d’onda. Quando la luce è focalizzata sul piano dell’immagine, la luce diffratta e la luce di fondo causano un’interferenza distruttiva o costruttiva, che cambia la luminosità delle aree che contengono il campione rispetto alla luce di fondo. Spesso lo sfondo viene anche oscurato dal 60 al 90% da un anello di filtro grigio.
