Heading

Die Pfropfung, eine alte agronomische Technik, ist eine Art der vegetativen/asexuellen Vermehrung von Pflanzen. Sie wird in der Regel durch Ausnutzung des Kalluswachstums nach einer Pflanzenverletzung durchgeführt. Das Pfropfen ist immer noch eine gängige Technik im Bereich des Gartenbaus. Die Pfropfung wird in der Landwirtschaft seit > 2 000 Jahren BCE (Before the Common Era) in China verwendet. Sie wird in der Landwirtschaft und bei der Kultivierung von Waldbäumen und Gartenbaupflanzen weit verbreitet eingesetzt. Zum Beispiel werden Sorten mit Pathogenresistenz oder Stresstoleranz meist als Unterlage verwendet, um die Wuchskraft von oberirdischen Sorten mit hohem wirtschaftlichen Wert zu verbessern. Das Pfropfen wurde auch verwendet, um das juvenile Stadium zu durchbrechen, um die Blüte bei verholzenden Arten zu fördern. Im Vergleich zu gentechnisch veränderten Pflanzen sind gepfropfte Pflanzen für die Öffentlichkeit schmackhafter. Die Pfropfung ist auch eine nützliche Technik in der pflanzenwissenschaftlichen Forschung. Beträchtliche Anstrengungen in dieser Richtung begannen in den 70er und 80er Jahren des letzten Jahrhunderts. Mit der rasanten Entwicklung der Biotechnologie hat sich der Schwerpunkt der Pfropfungsforschung jedoch allmählich von der Verbesserung der agronomischen Eigenschaften auf die Untersuchung der molekularen Mechanismen verlagert. Studien haben gezeigt, dass die Pfropfung ein hervorragendes Werkzeug ist, um Mechanismen aufzuklären, die an weitreichenden Signalprozessen in Pflanzen beteiligt sind, wie z.B. an der Blüte, der Auxinregulation, der Schwermetalltoleranz, der Bewegung kleiner RNAs, dem Ernährungszustand und dem nuklearen Silencing.

Es ist bekannt, dass die Faktoren, die die Überlebensrate von Pfropfungen beeinflussen, hauptsächlich von der Kompatibilität von Unterlage und Edelreis abhängen. Kompatibilität bezieht sich auf die Ähnlichkeit zwischen Unterlage und Edelreis in Bezug auf strukturelle, genetische und physiologische Merkmale und die Fähigkeit, sich nach der Veredelung aneinander anzupassen. Die Kompatibilität von Pfropfreben von denselben Pflanzen ist am stärksten; je weiter die Verwandtschaft zwischen den Pflanzen entfernt ist, desto schwächer ist die Kompatibilität zwischen ihnen. Es ist schwierig, Pflanzen aus verschiedenen Gattungen zu veredeln. Neben der Kompatibilität von Edelreis und Unterlage ist auch die Wuchsstärke von Unterlage und Edelreis ein wichtiger Faktor, der das Überleben der Pfropfung beeinflusst. Die Überlebensrate von gepfropften Pflanzen variiert auch mit der Art, und die Überlebensrate des Pfropfkörpers ist sogar bei derselben Art in unterschiedlichem Alter unterschiedlich. Darüber hinaus können auch Umweltfaktoren wie Temperatur, Feuchtigkeit und Lichtintensität die Überlebensrate von veredelten Pflanzen beeinflussen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es viele Faktoren gibt, die die Überlebensrate von Pfropfungen beeinflussen.

Arabidopsis thaliana und Eutrema salsugineum (Thellungiella salsuginea) gehören zur gleichen Familie Cruciferae, aber zu unterschiedlichen Gattungen. Arabidopsis thaliana wird als Modellpflanze in genetischen Studien an zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet. Eutrema Salsugineum (auch bekannt als Salzkresse) ist eine exzellente salztolerante Pflanze, und das Genom von E. salsugineum ist fertiggestellt. Ungefähr 95 % der Gene in E. salsugineum ähneln denen, die in Arabidopsis exprimiert werden, und die meisten Aminosäuresequenzen sind mit denen von Arabidopsis identisch. Eutrema salsugineum hat ein relativ kleines Kerngenom, etwa das Zweifache des Genoms von A. thaliana . Alle Ökotypen von E. salsugineum zeigen Resistenz gegen eine Reihe von Umweltstressoren wie Kälte, Trockenheit und oxidativen Stress. E. salsugineum hat aufgrund seiner extremen Salztoleranz Aufmerksamkeit erregt. Daher wurde die Salzkresse vor mehr als 20 Jahren als Modellhalophyt für die Untersuchung der Salztoleranz vorgeschlagen. Dies hat ein neues Fenster für die Forschung geöffnet, das eine breite Palette von Aspekten abdeckt, darunter nicht nur abiotischer Stress, sondern auch Photosynthese, stressbedingte Proteinfunktionen und Oberflächenwachsproduktion unter Verwendung von E. salsugineum als Modellpflanze. In Arabidopsis wurden mehrere Pfropfungsansätze entwickelt, um die systemische Signalübertragung zu untersuchen. Unseres Wissens nach gibt es jedoch keinen Bericht über Pfropfmethoden für E. salsugineum oder über Methoden zur Pfropfung zwischen Arabidopsis und Eutrema. Die Schwierigkeit der Pfropfung zwischen diesen Pflanzen ist signifikant hoch. Eine erfolgreiche Pfropfung dieser beiden Modellpflanzen wird helfen, entscheidende Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Stresstoleranz von Pflanzen zu gewinnen. Hier demonstrieren wir zwei sterile Mikro-Pfropfmethoden für intergenerische Pfropfungen zwischen Arabidopsis und Eutrema, mit den Vorteilen der Einfachheit und der hohen Überlebensrate.

Pfropfmethoden

In der vorliegenden Studie konzentrieren wir uns auf zwei effiziente sterile Sämlings-Mikro-Pfropfprotokolle zwischen Arabidopsis, einer salzempfindlichen Pflanze, und Salzkresse, einer salztoleranten Pflanze. Eine Methode war das Hypokotyl-Hypokotyl-Flachschneiden der Sämlinge, wie von Seung und Turnbull et al. mit einigen Modifikationen beschrieben. Die andere Methode war das Einschneiden von Pfropfreisern, was wir hier demonstrieren werden. Die hier verwendete Abkürzung A/E bedeutet, dass A. thaliana Edelreiser auf E. salsugineum Stämme gepfropft wurden, und umgekehrt bedeutet E/A, dass E. salsugineum Edelreiser auf A. thaliana Stämme gepfropft wurden. In einem Kontrollexperiment wurden Selbstpfropfungen von A. thaliana und E. salsugineum durchgeführt. Die selbst gepfropften Sämlinge von A. thaliana werden als A/A und die selbst gepfropften Sämlinge von E. salsugineum als E/E bezeichnet. Optimierte Veredelungsmethoden wurden auf verschiedene Unterlagen und Edelreiser angewendet. Für A/E wurde die Methode der Stecklingsveredelung verwendet (Abb. 1a) und die andere Methode, d.h. Hypokotyl-Hypokotyl-Flachschnitt wurde für A/A, E/E und E/A verwendet (Abb. 1c, d). Mit der konventionellen Veredelungsmethode (d.h. Hypokotyl-Hypokotyl-Flachschnitt) ist es relativ einfach, eine erfolgreiche Veredelung zu erreichen, und das anschließende Wachstum der veredelten Pflanzen ist in der Regel zufriedenstellend. Daher wird auf diese Methode hier nicht eingegangen.

Materialien und Wachstumsbedingungen

Die in dieser Studie verwendeten Samen von Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col) und E. salsugineum (Shandong, China) wurden in unserem Labor konserviert und vermehrt. Die Pflanzen wurden unter Langtags- (LD 16/8 h hell/dunkel) oder Kurztags- (SD 8/16 h hell/dunkel) Lichtbedingungen mit 22 °C/18 °C Tag/Nacht-Zyklen und einer Lichtintensität von 100 μmol m-2s-1 kultiviert.

Pfropfverfahren

Das Schritt-für-Schritt-Protokoll der Schnittpfropfmethode, die für A/E angewandt wurde, war wie folgt:

Vorbereitung des Wurzelstock- und Sprossmaterials: Salzkressesamen wurden mit 0.5% NaClO (Natriumhydrochlorit) für 6 min desinfiziert und anschließend 4-5 mal in destilliertem Wasser gespült und anschließend unter sterilen Bedingungen auf halbstarkem Murashige und Skoog (MS) Medium mit 1,0% Agar und 1% Zucker ausgesät. Eine Woche nach der Stratifizierungsbehandlung bei niedriger Temperatur (4 °C) wurden die Sämlinge in SD-Bedingungen überführt und 10-15 Tage (oder 7-10 Tage nach der Keimung) als Unterlagensämlinge vertikal mit Licht kultiviert. Für die Keimung der Arabidopsis-Samen waren die Sterilisationsmethode und die Wachstumsbedingungen die gleichen wie bei E. salsugineum, mit Ausnahme der Stratifikationsbehandlung bei niedriger Temperatur (4 °C), die 2-3 Tage dauerte. Das optimale Alter für die Veredelung von Arabidopsis-Sämlingen beträgt 3-5 Tage. Da die Keimzeit und Wachstumsgeschwindigkeit der beiden Arten unterschiedlich sind, wurden die Pflanzzeiten entsprechend angepasst. Normalerweise sollte Arabidopsis nach der Keimung der Salzkressesamen gepflanzt werden.

1. Pfropfen unter sterilen Bedingungen (Abb. 1a): Die Pfropfung wurde unter anatomischen Mikroskopen in einer Sterilhaube durchgeführt. E. salsugineum-Sämlinge einheitlicher Größe wurden mit einer Pinzette auf neues 1,0 %iges, halbfestes MS-Agar-Medium umgesetzt. Um als Wurzelstöcke verwendet zu werden, wurden die echten Blätter und Meristeme mit einem zweischneidigen Rasiermesser aus rostfreiem Stahl von den Sämlingen der Salzkresse entfernt, während die Keimblätter erhalten blieben. Unter den gleichen sterilen Bedingungen wurde der Hypokotyl von A. thaliana-Sämlingen bei etwa einem Viertel der Höhe von oben (typischerweise 2-3 mm) quer durchgeschnitten und der obere Teil des Sämlings als Edelreiser verwendet. Der Schnitt von A. thaliana als Edelreiser kann direkt in den ursprünglichen Nährbodenplatten oder in den Platten, in denen die Salzkresse als Unterlage präpariert wurde, durchgeführt werden. Das A. thaliana-Spross wurde auf die Salzkresse ohne jegliche Befestigungen aufgepfropft, da die geringe Menge an Flüssigkeit an den Schnittflächen der beiden Teile ausreicht, um sie zusammenzuhalten. Anschließend wurde die Petrischale zügig, aber sorgfältig mit Parafilm verschlossen, um die Feuchtigkeit zu erhalten. Bitte achten Sie darauf, dass die Blätter natürlich ausgezogen sind, um ein mögliches Ablösen durch das Pflanzenwachstum zu verhindern.

2. Kultivierung des gepfropften Körpers: Der veredelte A/E-Komplex wurde für 6-8 Tage unter SD-Bedingungen in einem Percival-Wachstumsschrank platziert.

3. Transplantation der veredelten Sämlinge (Abb. 2): Sechs bis acht Tage nach der Transplantation wurde die Schnittstelle der Stoßverbindung unter einem anatomischen Mikroskop untersucht. Das erfolgreiche Pfropfen sollte zu diesem Zeitpunkt eine feste Verbindung zwischen dem Edelreis und dem Stamm aufweisen. Die Sämlinge wurden dann je nach Bedarf in ein hydroponisches System oder in nährstoffreiche Erde umgesetzt. Nach dem Umpflanzen sollte darauf geachtet werden, Adventivwurzeln rechtzeitig abzuschneiden, falls diese auftreten.

   

   Erfolgreich gepfropfte Sämlinge. a Selbstpfropfung von A. thaliana (A/A). b A/E gepfropfte Sämlinge. c Selbstpfropfung von E. salsugineum (E/E). d E/A gepfropfte Sämlinge. Die roten Pfeile in a-c zeigen die Pfropfstellen an. Arabidopsis thaliana-Wurzeln als Unterlage sind in d durch verschiedenfarbige Pfeile dargestellt, blaue Pfeile zeigen die Wurzeln nach der Pfropfung an, und gelbe Pfeile zeigen die Wurzeln vor der Veredelung an

Oberflächendesinfektion der Samen

Bei der Cut-in-Veredelungsmethode wurde die Oberfläche der Samen direkt mit 0.5% Natriumhydrochlorid (NaClO) für 6-8 min desinfiziert und anschließend 4-6 mal mit sterilem Wasser gewaschen. Diese Methode vermeidet die Verwendung von Alkohol zur Sterilisation. Außerdem ist die Sterilisationsmethode mit NaClO einfach, wodurch die Sekundärverschmutzung reduziert wird, und die Samen können normal keimen. Es vermeidet auch die Nicht-Keimung von Samen aufgrund einer Übersterilisation, die die Keimung der Samen und die anschließenden Analysen beeinträchtigt. Solange die NaClO-Konzentration richtig kontrolliert wird, tritt keine Übersterilisation auf, selbst wenn die Sterilisation mehrere Minuten dauert.

Sämlingsalter

Bei der Cut-in-Veredelungsmethode werden etwas ältere E. salsugineum-Sämlinge (7-10 Tage nach dem Austrieb) mit Seitenwurzeln den schnellen Wachstumseigenschaften ihrer Edelreiser (A. thaliana) besser gerecht werden, was auch die Bildung von Adventivwurzeln reduziert, die Überlebensrate der Pfropfungen stark verbessert und das kräftige Wachstum der veredelten Sämlinge im späteren Stadium gewährleistet (Tabelle 1). Wir fanden heraus, dass 3-5 Tage alte Sämlinge von Arabidopsis günstig waren, um die Überlebensrate der gepfropften Sämlinge zu verbessern; es unterstützt auch das kräftige Wachstum der gepfropften Sämlinge (Tabelle 1). Dies könnte daran liegen, dass der Lebenszyklus von A. thaliana im Vergleich zu dem von E. salsugineum kurz ist. Daher führte die Verwendung älterer A. thaliana-Sämlinge als Edelreiser zu geringen Überlebensraten; selbst wenn die A/E-Pfropfreiser überlebten, war das Wachstum in späteren Stadien schlecht und eine frühe Blüte wird meist beobachtet.

Flachschnitt-Methode

Viele Arten von Pfropfmethoden wurden für A. thaliana berichtet. In der vorliegenden Studie wurde die Methode des Einschnittpfropfens nur für A/E-Transplantate und die Methode des Hypokotyl-Hypokotyl-Flachschnittes für A/A, E/E und E/A verwendet (Abb. 1c, d). Die beiden Methoden erfordern bis auf die Schnittstelle die gleichen Kulturbedingungen. Für die A/A-Selbstveredelung wurden 3-5 Tage alte Sämlinge verwendet. Für die E/A-Pfropfung sind 7 bis 10 Tage alte Sämlinge von A. thaliana als Unterlage günstiger für das Überleben der Pfropfreiser. In ähnlicher Weise wurden 7-10 Tage alte Sämlinge für die E/E-Selbstveredelung verwendet. Wir stellten fest, dass sowohl die Überlebensrate als auch das spätere Wachstum der A/E-Sämlinge zwischen den beiden Pfropfmethoden signifikant unterschiedlich waren (Abb. 1a, b und Tab. 2). Die Stecklingsmethode ist für die A/E-Veredelung zufriedenstellender. Der Hauptgrund dafür könnte sein, dass die schnelle Wachstumsrate von A. thaliana mit dieser Methode besser zu bewältigen ist. Wenn der traditionelle Flachschnitt für die A/E-Pfropfung verwendet wurde, erscheinen Adventivwurzeln vom Edelreis vor der Kallusbildung an der Verbindungsstelle, was die Erfolgsrate der gepfropften Pflanzen beeinträchtigt, da das Wachstum der Salzkresse langsamer ist als das von A. thaliana. Im Vergleich dazu liegt die Erfolgsrate der Stecklingsmethode bei fast 100 %, solange der Schnitt glatt ist und die beiden Teile dicht beieinander liegen.