Inleiding
Autoimmuunziekten vertegenwoordigen een grote verscheidenheid aan klinische problemen die meerdere organen en systemen aantasten, en die ten minste 5% van de bevolking treffen.1 Een grote diversiteit aan antilichamen is in verband gebracht met verschillende klinische manifestaties en clinici hebben zich hierop gebaseerd bij het stellen van een klinische diagnose, prognostische implicaties en in sommige gevallen therapeutische beslissingen.2,3 De huidige kennis over de pathogenese van auto-immuunziekten is het erover eens dat een complexe interactie van genen en omgevingskenmerken nodig is voor het ontstaan ervan.4
Combinatie van de line immunoblot ENA assay (INNOLIA-ANA) en indirecte immunofluorescentietechnieken om antinucleaire antilichamen op te sporen in HEp-2-cellen als substraat zijn goede screeningsmethoden bij patiënten met een klinische verdenking op een auto-immuunziekte, voornamelijk systemische lupus erythematosus (SLE) en het syndroom van Sjögren (SS). Hoewel vals-positieve resultaten kunnen voorkomen, suggereren titers >1:80 de mogelijkheid van een auto-immuunziekte en zouden aanleiding moeten geven tot het bestellen van meer specifieke evaluaties om specifieke reactiviteiten van de antinucleaire antilichamen (ANA) te bepalen, zoals anti-dubbelstrengs DNA en extraheerbare nucleaire antigenen (ENA).5
Ro/SSA en La/SSB zijn heterogene antigene complexen, gevormd door drie verschillende eiwitten (Ro-52, Ro-60 en La) en vier YRNA-deeltjes. Het Ro60-eiwit fungeert als een kwaliteitscontrolepunt voor verkeerd gevouwen RNA met moleculaire chaperonnes voor defecte RNA’s. De verkeerd gevouwen RNA’s worden herkend en vervolgens door Ro60 gelabeld voor afbraak. Ro52 interageert met verschillende moleculen, waaronder calreticulin en het immunoglobuline zware keten-bindend eiwit. Er wordt verondersteld dat Ro52 de rol of stabiliteit van zijn substraten wijzigt door ubiquitinatie, en deze wijziging zou kunnen resulteren in de door Ro52 gemedieerde biologische gebeurtenissen.6
Anti-Ro/SSA en anti-La/SSB antilichamen zijn beschreven in verschillende auto-immuunziekten. Bij het primair syndroom van Sjögren (pSS) worden circulerende antilichamen gedetecteerd bij ongeveer 60-70% van de patiënten, en hogere niveaus werden geassocieerd met een vroeg begin van de ziekte en systemische manifestaties.7,8 De GEMESS Study Group, die 12 referentiecentra in Spanje omvatte, bevestigde deze klinische en laboratoriumkenmerken in een cohort van patiënten met pSS, en observeerde verlaagde niveaus van C4 bij patiënten met een vroeg begin van de ziekte.9
Anti-Ro/SSA wordt bij 30% van de patiënten met de diagnose SLE aangetoond, vooral (90%) bij de subtypes met een laat begin, subacute cutane lupus erythematosus, door geneesmiddelen geïnduceerde lupus en congenitale deficiënties van C2, C4 en C1q, ook bij patiënten met het SS/SLE overlappingssyndroom en ongedifferentieerde bindweefselziekte.10 Daarentegen is anti-La/SSB vaker geassocieerd met SS,11 en sterk gecorreleerd in anti-La/SSB positief met anti-Ro/SSA negatief aan orgaan disfunctie (nieren, longen, lever).12
Sinds de jaren tachtig is de ontwikkeling van congenitale hartblokkade beschreven bij auto-immuunziekten, zoals SS en SLE. De cardiale betrokkenheid hangt echter meer samen met circulerende antilichamen van de moeder dan met de diagnose van een auto-immuunziekte. Hoewel het immuunprofiel variabel is tussen verschillende studies komt het anti-Ro52 antilichaam vaker voor bij moeders van kinderen met congenitale hartblokkade, neonatale lupus, en neonaten met verlengd QT zonder congenitale hartblokkade.10,13,14
Prevalentie en klinische associaties van anti-Ro/SSA en anti-La/SSB antilichamen kunnen verschillen in verschillende etnische groepen. Naast studies uitgevoerd bij de Spaanse bevolking naar de immune expressie van SS, zijn er de laatste jaren andere studies ontwikkeld naar het immuunprofiel van patiënten met anti-Ro52, anti-Ro60 en anti-La antilichamen. De meeste daarvan zijn uitgevoerd op specifieke diagnoses van bindweefselaandoeningen. In een cohort van patiënten met pSS, ontwikkeld in Korea, werden associaties van deze antilichamen met verschillende klinische manifestaties waargenomen. Anti-Ro52 was het meest frequente auto-antilichaam en gerelateerd met lever- en spierschade.15 Een recente studie in de Mexicaanse populatie om de prevalentie van pSS te bepalen bij recent ontstane SLE toonde de aanwezigheid van anti-Ro/SSA aan als voorspeller van overlap, terwijl de afwezigheid van anti-Ro/SSA, anti-La/SSB en reumafactor gerelateerd was aan het laagste risico op overlap.16 Tenslotte stelde het Universitair Ziekenhuis Gent een studie voor om de diagnostische spreiding te bepalen geassocieerd met serotype van anti-Ro/SSA of anti-La/SSB bij opeenvolgende patiënten die verwezen werden naar het reumatologisch laboratorium. SLE werd geassocieerd met anti-Ro60 positief en geïsoleerde anti-La predisponeerde meer voor pSS.17
Wij hebben deze studie ondernomen om de klinische, laboratorium en diagnose associaties van deze belangrijke subset van antilichamen in een ziekenhuis in Spanje te evalueren.
MethodsOnderzoekscentrum
Hospital de Jerez de la Frontera is een regionaal gespecialiseerd centrum gelegen in het zuidwesten van Spanje. Het biedt gespecialiseerde klinische diensten en heeft 550 bedden. De afdeling Immunologie analyseert ongeveer 5800 ANA-tests en 1700 immunoblot ENA-tests per jaar op een bevolking van 450.000 inwoners. Onder het laboratoriumpersoneel bevinden zich een bioloog en een immunoloog die gespecialiseerde tests uitvoeren voor verschillende afdelingen. Elke praktiserende arts kan antinucleaire antilichaamstesten bestellen, maar ze worden vooral aangevraagd door reumatologen, gevolgd door huisartsen, gastro-enterologen, internisten, nefrologen, pneumologen en hematologen.
Stalen
Een geautomatiseerd register van laboratoriumresultaten is beschikbaar sinds juni 2002. Wij analyseerden retrospectief alle opeenvolgende monsters die een ANA-test bestelden van juni 2002 tot december 2012. Sera met een titter van ten minste 1:160 door immunofluorescentie assay op HEp-2 cellen (Euroimmun, Duitsland) werden als positief beschouwd en uitgevoerd door een enkele getrainde observator. De sera met een positieve ANA-test voor deze titerverdunning werden geanalyseerd met een commercieel verkrijgbare lineaire immunoblot ENA-test (INNO-LIA ANA, Fujirebio, Japan). Deze kit biedt een kwalitatieve in vitro assay voor menselijke autoantilichamen van de IgG-klasse tegen 13 verschillende antigenen: RNP-70, RNP-A, RNP-C, Ro-52, Ro-60, La/SSB, Scl-70, CENP-B, histonen, Jo-1, Sm, P ribosomaal eiwit en U1-nRNP complex in serum of plasma. De algemene gevoeligheid en specificiteit van auto-antilichaam detectie door LIA was vergelijkbaar of hoger in vergelijking met gecombineerde conventionele technieken.18,19 Deze immunoblot heeft een specificiteit van 99,6% voor anti-La, terwijl anti-Ro60 een specificiteit van 98,2% heeft, en anti-Ro52 een specificiteit van 98,3%.20
Daarnaast stelt het computersysteem ons in staat om in de immunoassay anti-Ro en/of anti-La positief te detecteren met een negatieve ANA test, omdat bij patiënten met een hoge klinische verdenking op een auto-immuunziekte de immunoblot ENA assay werd uitgevoerd ondanks een negatieve ANA test. Tenslotte werden alleen patiënten met meer dan één positief serummonster voor anti-Ro/SSA of anti-La/SSB in de studie opgenomen.
Clinische en laboratoriumgegevens werden verkregen door ofwel twee getrainde waarnemers door het doornemen van klinische kaarten of een geautomatiseerde laboratoriumdatabank.
Variabelen
Onafhankelijke variabelen waren demografische (leeftijd, geslacht), klinische (diagnose, ziektekenmerken), laboratorium (hemoglobine, leukocyten- en bloedplaatjesaantallen, schildklierhormoonspiegels) of immunologische (complementspiegels, hypergammaglobulinemie, reumafactor).
Statistische analyse
Descriptieve statistieken werden gebruikt met frequenties en percentages voor kwalitatieve variabelen en gemiddelde, standaarddeviatie, en bereik voor kwantitatieve variabelen. Klinische associaties tussen verschillende sets van positieve combinaties met klinische of laboratoriumvariabelen werden geanalyseerd door contingentietabellen met behulp van chi kwadraat of Fisher’s exact tests. In alle gevallen werd het alfa-niveau vastgesteld op 0,01 als correctie voor meervoudige vergelijkingen. De sterkte van de associatie wordt weergegeven als odds ratio en zijn 99% betrouwbaarheidsintervallen. Wij voerden de clusteranalyse van variabelen uit met gebruikmaking van de gemiddelde koppeling tussen groepen, en met als intervalmaat de gekwadrateerde Euclidische afstand. Analyses werden uitgevoerd met SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultaten
Er werden in totaal 41.102 serummonsters doorverwezen naar de afdeling Immunologie voor ANA-detectie. 12.124 monsters waren positief van 2970 patiënten. 322 patiënten met meer dan één positief serummonster voor anti-Ro52 en/of anti-Ro60 en/of anti-La antilichamen met titerverdunning >160 werden geïncludeerd. Vrouwen vertegenwoordigden 90,4% van de steekproef. Zij hadden een leeftijd tussen 10 en 84 jaar, gemiddeld 44,4 en standaarddeviatie 15,7 jaar. Sommige geïsoleerde sera waren positief voor immunoblot ENA-test met negatieve ANA-test. Maar de 322 patiënten toonden alle of de meeste van hun sera positief voor de ANA-test, en het patroon van de sera voor elke patiënt was vrijwel identiek. Geen enkele patiënt werd in onze studie gevonden met meer dan één sera negatieve test voor IIF.
De belangrijkste klinische en laboratoriumgegevens van patiënten met positieve monsters voor anti-Ro52 en/of anti-Ro60 en/of anti-La (322 gevallen) worden gepresenteerd in Tabel 1. De specificiteit van de verschillende antigenen van deze patiënten is weergegeven in tabel 2. We kunnen zien dat de meest frequente positieve bevinding anti-Ro52 was bij 269 patiënten (83,5%), gevolgd door 205 patiënten met anti-Ro60 (63,7%) en 155 met anti-La (48,1%).
Tabel 3 toont verschillende associaties tussen combinaties van antilichamen anti-Ro52/anti-Ro60/anti-La en diagnose, klinische of laboratoriumresultaten. Tabel 4 toont significante associaties van positieve test op de aanwezigheid van circulerende antilichamen anti-Ro52, anti-Ro60 en anti-La. Omdat een strikt significantieniveau werd gekozen, werden sommige interessante associaties niet gepresenteerd zoals de groep anti-Ro52+ met cytoplasmatisch patroon (OR 3,72, 99% CI: 0,9-16, p waarde 0,04) en de groep anti-Ro60+ met subacute cutane lupus (SCLE) (OR 7,0, 99% CI: 0,9-55,3, p: 0,023).
Met behulp van clusteranalyse kunnen vier groepen auto-antilichamen worden geïdentificeerd. Cluster 1 omvat antilichamen tegen SmB, SmD, RNP,70, RNP-A en RNP-C. Cluster 2 wordt gevormd voor antilichamen tegen Scl-70, Ribosomal P, Jo1 en centromeer. Cluster 3 wordt gevormd voor antilichamen tegen Ro60 en SSB. Cluster 4 bestond uit antilichamen tegen Ro52 (Fig. 1).
Clusteranalyse om clusters van antilichamen in onze patiëntensteekproef te identificeren.
Discussie
Rheumatologen hebben het belang vastgesteld van klinische en serologische bevindingen bij het classificeren van veel auto-immuunziekten. Er is enige bezorgdheid gepubliceerd over het belang van een kritische evaluatie van gespecialiseerde tests in de klinische zorg. Het lijkt erop dat het bestellen van vele tests meerdere laboratoriumresultaten zou kunnen opleveren die zorgvuldig geëvalueerd moeten worden in de context van de klinische bevindingen.17,21
In onze studie beschrijven we de klinische, diagnostische en immunologische associaties met alle verschillende mogelijke combinaties van anti-Ro52, anti-Ro60 en anti-La antilichamen, gevonden in een groot cohort van patiënten uit één centrum in Spanje gedurende 10 jaar. In totaal 322 patiënten vertoonden meer dan één positiviteit voor deze antilichamen, en de meest voorkomende ziekten waren SLE en pSS, voornamelijk geassocieerd met immunologische profielen anti-Ro52+/anti-Ro60+/anti-La- en anti-Ro52+/anti-Ro60+/anti-La+, respectievelijk.
Onze strikte definitie van statistische significantie kon maken dat sommige associaties verloren gingen, maar wij zijn ervan overtuigd dat beschreven associaties robuuster kunnen zijn. De klinische en praktische relevantie van deze associaties zou bijzonder interessant kunnen zijn voor geïsoleerde anti-Ro52 (anti-Ro52+/anti-Ro60-/anti-La-). Deze subset van autoantistoffen heeft onafhankelijke klinische en immunologische associaties, gegevens die bevestigd werden in onze clusteranalyse.22,23 Positieve geïsoleerde anti-Ro52 antistoffen waren geassocieerd met systemische sclerose, vooral bij personen met het CREST syndroom, en dermatomyositis (OR 11,65, 99% CI: 1,28-105,79, p: 0,018). Andere associaties werden vooral gezien met bepaalde laboratoriumbevindingen zoals anti-Jo-1 (OR 3,45, 99% CI: 1,12-10,59, p: 0,03), anti-centromeer (OR 2,66, 99% CI: 1,04-2,80, p: 0,03) of bepaalde immunofluorescentiepatronen zoals centromeer-, cytoplasmatisch en nucleolair patroon. Bovendien, bij vergelijking van de geïsoleerde positieve anti-Ro52+ groep (anti-Ro52+/anti-Ro60-/anti-La-) met positieve drievoudige reactiviteit (anti-Ro52+/anti-Ro60+/anti-La+) waren de klinische, laboratorium en diagnose associaties die in de ene groep gevonden werden, tegengesteld in de andere. Zo was de immunologische subset anti-Ro52+/anti-Ro60+/anti-La+ positief geassocieerd met xerostomie en fijn gespikkeld patroon en negatief met systemische sclerose (OR 0,22, 99% CI: 0,05-1,00, p: 0,026). Dit onderstreept de diagnostische klinische waarde van de combinatie. Met betrekking tot positieve testuitslag voor de groep anti-Ro60+, voornamelijk geassocieerd met anti-La- (anti-Ro52+/anti-Ro60+/anti-La- en anti-Ro52-/anti-Ro60+/anti-La-), was zeer indicatief voor SLE.
Onze bevindingen zijn vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd.6,22-25 De aanwezigheid van circulerende antilichamen anti-Ro52, anti-Ro60 en anti-La positief predisponeerde voor xerostomie en xerophthalmie (xerostomie bij anti-Ro60 OR 1,75, 99% CI: 1,10-2,79, p: 0,012). Deze klinische gegevens worden ondersteund door talrijke studies over de pSS.6-9,11,17,24 Positieve anti-Ro52 met negatieve anti-Ro60 en anti-La vertoonden een negatieve associatie met lichtgevoeligheid, maar in eerdere studies hadden patiënten met anti-Ro52+ een hogere frequentie van cutane betrokkenheid.17,26 Bovendien was deze immunologische combinatie (anti-Ro52+/anti-Ro60-/anti-La-) ook invers geassocieerd met xerostomie en xerophthalmie. In eerdere studies was geïsoleerde positieve anti-Ro52 echter nauw gerelateerd met de belangrijkste klinische, histopathologische en immunologische kenmerken van pSS.27 Geïsoleerde positieve anti-Ro60 of anti-Ro60+ gecombineerd met anti-Ro52+ verhoogde de kans op SLE of overlap SLE/SS, zoals beschreven in verschillende werken,11,17,28 maar was ook in ons cohort sterk geassocieerd met orale ulcera en arthritis. Anti-La reactiviteit was sterk geassocieerd met pSS en de belangrijkste klinische manifestaties (xerostomie en xerophthalmie), zoals in vele andere studies in verschillende populaties.11,17,26
De meeste eerdere onderzoeken naar de bruikbaarheid van deze antilichamen zijn uitgevoerd op monsters van patiënten met een gediagnosticeerde auto-immuunziekte, vooral SLE en SS. Er zijn echter weinig studies verricht om de diagnostische associatie te beschrijven van anti-Ro en anti-La antilichamen die zijn geïdentificeerd in een opeenvolgende steekproef.17
Naast de diagnose bepaalden wij het nut van de immunologische profielen met anti-Ro52 en/of anti-Ro60 en/of anti-La in de voorspelling van klinische en laboratoriumgegevens in een opeenvolgende steekproef van patiënten en deze zijn besteld voor alle afdelingen van ziekenhuis en eerstelijnsgezondheidszorg. Wij hebben alle monsters van elke patiënt in deze periode bekeken en de meest voorkomende combinatie van anti-Ro52, anti-Ro60 en anti-La reactiviteit geregistreerd. De gekozen afkappunt voor positiviteit >160 verhoogt de geldigheid van de studie, omdat een positieve ANA-test en anti-Ro/SSA- en anti-La/SSB-test bij respectievelijk 25-30% en 1,6% van de gezonde personen kunnen worden gedetecteerd. Hun prevalentie is hoger met de leeftijd, en de positiviteit zonder relevante klinische gegevens kan misleidend zijn.29
In onze studie toonden we dus aan dat een immuunprofiel ons kan leiden tot een bepaalde diagnose of de ontwikkeling van ziekteverschijnselen. Dit is belangrijker bij het ontstaan van auto-immuunziekten, omdat circulerende antilichamen al enkele jaren voor de ziektediagnose aanwezig kunnen zijn en een indicatie kunnen geven van de ernst van de ziekteverschijnselen.17,30
Een aantal beperkingen die inherent zijn aan deze studies zijn de retrospectieve klinische evaluaties van klinische kaarten en de mogelijke diagnostische biases bij behandelend artsen die deze patiënten zien en gespecialiseerde laboratoriumtesten bestellen. Veel van onze patiënten met een positieve ANA-test waren negatief voor de bepaling van de immunoblot ENA-test. Dit zou te maken kunnen hebben met het type immunoassay dat ontwikkeld is. In gevallen met een hoge klinische verdenking wordt specifieke antilichaamdetectie aanbevolen.11
Ethische openbaarmakingenBescherming van mens en dier
De auteurs verklaren dat in dit onderzoek geen experimenten op mens of dier zijn uitgevoerd.
Geheimhouding van gegevens
De auteurs verklaren dat zij de protocollen van de werkplaats over de publicatie van patiëntgegevens hebben gevolgd.
Recht op privacy en geïnformeerde toestemming
De auteurs verklaren dat in dit artikel geen patiëntgegevens worden vermeld.
Belangenverstrengeling
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.