Geschiedenis
Het klonen van runderen begon in ons laboratorium in 1986 met de introductie van embryonale splitsingsstadium kerndonorcellen in geënucleerde metafase II oöcyten, wat resulteerde in de dracht en geboorte van twee gezonde kalveren (Prather et al., 1987). Ons succes en het succes bij Granada Genetics in dezelfde periode werden mogelijk gemaakt door verschillende factoren. Studies bij amfibieën toonden aan dat een meer gevorderde ontwikkeling optrad bij de overdracht van kernen in geënucleerde metafase oöcyten in plaats van geënucleerde pronucleaire zygotes (Hoffner en DiBerardino, 1980). Studies in muizen toonden aan dat de ontwikkelingsfrequentie na nucleaire transfer (NT) veel hoger was wanneer kernen in muizenocyt werden gefuseerd in plaats van microgeïnjecteerd (McGrath en Solter, 1983). De studies van Willadsen (1986) bij schapen toonden aan dat lammeren konden worden geproduceerd door elektrofusie van embryonale stamcellen in geënucleerde metafase II oöcyten. De opkomst van methoden voor de productie van embryo’s in vitro en voor het kweken van embryo’s tot het blastocyststadium vergemakkelijkte ook de komst van het klonen van runderen, aangezien runderembryo’s gewoonlijk in het blastocyststadium in koeien werden overgebracht om nakomelingen te produceren (First, 1990; Gordon, 1994; Fulka et al,
In deze vroege studies werden embryonale stamcellen van het blastocyststadium tot het morulastadium gebruikt voor overbrenging naar geënucleerde metafase oöcyten, omdat de vroege amfibieënliteratuur suggereerde dat embryonale stamcellen totipotent waren, maar dat somatische of foetale gedifferentieerde cellen dat niet waren (DiBerardino, 1988; DiBerardino, 1997). Dit werd bij zoogdieren bevestigd door studies zoals die van Navara et al. (1994). In deze studie werden gepolariseerde en trofoblast lineage gecommitteerde cellen gebruikt als kerndonors en dit resulteerde in zeer weinig blastocyst-stadium embryo’s (7%; n=158), terwijl niet-gepolariseerde en ongedifferentieerde cellen gebruikt als kerndonors een hoge frequentie blastocysten opleverden (47%; n=184). Ter vergelijking: 30% van de 139 niet-geselecteerde embryo’s ontwikkelde zich tot het blastocyststadium. De conclusie in de jaren ’80 dat alleen ongedifferentieerde celtypen ontwikkelingsrendabel waren als kerndonor, was te wijten aan de grote technische beperking dat kunstmatige methoden niet in staat waren oöcyten zo snel en effectief te activeren als sperma (Ware et al., 1989). Dit dwong tot het gebruik van oudere oöcyten, die het vermogen hadden verloren om een gedifferentieerde kern te herprogrammeren. Een vergelijking van jonge en oude oöcyten is te zien in Tabel 20.1 van het Eerste laboratorium. In feite werd met veel vroege protocollen het beste succes bereikt wanneer de oöcyt zo oud was dat de kernomhulling van de donorcel en zijn inhoud in toto behouden bleven zonder afbraak van de kernomhulling (Saeki e.a., 1991; Leibfried-Rutledge e.a., 1992; Poccia en Collas, 1997). Bij matig verouderde oöcyten zou afbraak van het kernomhulsel mogelijk zijn, maar zou het kernomhulsel snel weer worden opgebouwd en zou een deel van het chromatine uit de kern worden verwijderd.
Tabel 20.1. Gebruik van jonge versus verouderde oöcyten bij nucleaire transfer
| Proces | 24 uur | 48 uur |
|---|---|---|
| Kunstmatige activering | Slecht | Uitstekend |
| Ja | Nee | |
| Synchronie van kern en eicel | Essentieel | Niet essentieel |
| Cellulaire en genomische herprogrammering van donorcel | Ja | Nee |
| Sequentie en timing van activering | Kritisch | Niet kritisch |
| Succesvolle donorcellen | Gedifferentieerde volwassen of foetale | Totipotente embryonale |
Het vermogen om jonge runderocyten te activeren ontstond door de ontwikkeling van procedures die de activiteit van metafasebevorderende factor (MPF) en cycyten meer volledig en continu onderdrukten.bevorderende factor (MPF) en cytostatische factor (CSF), in vergelijking met Ca2+ ionoforen (Liu en Yang, 1999). MPF wordt gemeten aan de hand van de H1 kinase activiteit en CSF aan de hand van de mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit; samen houden zij metafase oöcyten in meiotische arrest. Dit vermogen om jonge oöcyten te activeren vormde de basis voor het gebruik van het vermogen van metafase II oöcyten om foetale of somatische nucleaire donorcellen in NT te herprogrammeren. Een van deze procedures is de activering van jonge metafase II oöcyten met een calciumionofoor, gevolgd door een 4- tot 6-h blootstelling aan 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) om te interfereren met de fosforylering van serine en threonine residuen op MPF en MAPK (Susko-Parrish et al., 1994). Een andere methode gebruikt butyrolacton voor hetzelfde doel (Motlik et al., 1998; Motlik et al., 2002). Een studie van het verband tussen MPF, MAPK en de dynamiek van de nucleaire progressie tijdens de activering van jonge en oudere runderocyten suggereerde dat de inactivering van MPF en MAPK een voorwaarde is voor het loslaten van de metafase-arrestatie en de vorming van pronuclei in runderocyten (Tian et al., 2003). Jang et al. (2005) vergeleken de ontwikkelingscompetentie van somatische cel nucleaire transfer (SCNT) embryo’s gereconstrueerd met verschillende donorcellen en analyseerden de genexpressie in het resulterende embryo.
Activering kan ook worden bereikt door remming van de eiwitsynthese met cycloheximide (CHX) na een ionofore behandeling, gevolgd door incubatie met cytochalasine B (CB) om chromatine-extrusie uit de cel te voorkomen en zo een diploïde toestand te handhaven (Liu en Yang, 1999). Bhak et al. (2006) onderzochten de ontwikkelingssnelheid en ploïdie van embryo’s geproduceerd door NT met verschillende activeringsbehandelingen bij runderen. In deze studie werden drie methoden voor oocytactivering, namelijk ionomycine alleen, ionomycine+DMAP, en ionomycine, en CHX, vergeleken voor de ontwikkeling van embryo’s geproduceerd door SCNT tot parthenotes en IVF tegenhangers. De resultaten suggereren dat DMAP-behandeling na ionomycine de ontwikkelingssnelheid van parthenotes sterk verhoogt, maar niet verschilt in blastocyst-ontwikkeling vergeleken met CHX-behandeling. DMAP-behandeling verhoogde echter het tijdsafhankelijke splitsingspercentage tot embryo’s in het tweecellig stadium. Verder verhoogde het de incidentie van chromosomale afwijkingen in parthenotes en SCNT embryo’s. Bhak et al. (2006) concludeerden dat CHX in combinatie met ionomycine wenselijker is dan DMAP voor de activering van de eicel tijdens NT bij runderen. Dehydroleucodine (DhL) werd geëvalueerd als een chemische activator van runderoöcyten en SCNT gereconstitueerde embryo’s (Bhak et al., 2006). Meer recent werd DhL geëvalueerd als een chemische activator van runderoöcyten en SCNT gereconstitueerde embryo’s (Canel et al., 2010). Oöcyten werden geactiveerd met lage en hoge doses ionomycine en blootgesteld aan lage en hoge doses DhL alleen of, afwisselend, gecombineerd met CB. De resultaten toonden aan dat DhL een dynamiek van pronucleaire vorming induceert die meer leek op IVF-geproduceerde embryo’s dan DMAP en dat lage niveaus van DhL de ontwikkeling van blastocysten vergemakkelijken. Deze resultaten geven aan dat een laag niveau van DhL1 gecombineerd met een lange blootstelling aan CB protocol nuttig zou kunnen zijn voor SCNT programma’s (Canel et al., 2010).
Met embryonale cellen als donor heeft 20-50% van de nucleaire transfers geresulteerd in blastocysten voor overbrenging naar koeien, waarvan ongeveer 50% zwanger wordt.
In 1993 waren er honderden kalveren geproduceerd uit NT met embryonale cellen als kerndonor. Tot op heden is dit aantal gegroeid, maar niet exponentieel zoals men zou verwachten. Succesvolle NT vereist het volledig wissen van de genomische inprenting en de methyleringsstatus en een perfecte herprogrammering van het genoom van de donorcel. Het geherprogrammeerde genoom moet gedurende de ontwikkeling stabiel blijven en uiteindelijk resulteren in een levensvatbaar nageslacht met normaal gedifferentieerde organen. Er is gebruik gemaakt van herprogrammering van ingevroren donorcellen, ingevroren organen zonder cryoprotectans en in vitro gerijpte eicellen (Stice en Keefer, 1993; Barnes et al., 1993). In het beste geval heeft 20-50% van de NT’s geresulteerd in blastocysten voor overbrenging naar koeien, waarvan ongeveer 50% drachtig wordt. De drachtverliezen zijn echter groter dan normaal, waarbij maar liefst 20% niet werpt en inleiden van de bevalling nodig is, met vaak grotere kalveren dan normaal als gevolg (Rodriguez-Osorio et al., 2009, 2012; Oback and Wells, 2007; Cibelli, 2007; Niemann et al., 2008; Kato et al., 1998; Oback 2009).
Commerciële bedrijven hebben geprobeerd de efficiëntie van embryonaal klonen te verbeteren tot een niveau en tegen een kostprijs die geschikt is voor commerciële veehouderij. Helaas is een voldoende niveau van efficiëntie nog niet bereikt. Bij melkvee was voor de productie van embryonale klonen van runderen met een hoge melkproductie een opfok tot melkproductie nodig en vervolgens selectie van embryonale klonale lijnen met een hoge melkproductie. De commerciële belangstelling voor embryonaal klonen verdween met de komst van het klonen uit primordiale kiemcellen en foetale of volwassen somatische cellijnen. Er worden nog steeds pogingen ondernomen om runderembryonale stamcellen te kweken tot aantallen die groot genoeg zijn voor genoverdracht en transgene kolonieselectie vóór NT (Mitalipova et al., 2001; Merton et al., 2003; Rodriguez-Martinez 2012). Recentelijk zijn geïnduceerde pluripotente stamcellen gebruikt in met genen gemodificeerde runderen en transgene foktoepassingen (Cao et al., 2012; Han et al., 2011; Dong et al., 2007).