Heading

2.1. Groei-eigenschappen van S. boulardii

Om deze gist verder te karakteriseren, worden zijn groei-eigenschappen bij verschillende temperaturen vergeleken met andere diploïde giststammen (alle gebruikte giststammen zijn samengevat in tabel 1). S. boulardii (ik zal deze naam in de tekst aanhouden, ook al is het een S. cerevisiae-stam) groeit goed op een rijk medium bij 30°C en bij 37°C, maar niet bij 40°C (Figuur 1A). Groei bij 37°C – hoewel niet ideaal – is niet ongewoon voor giststammen zoals de diploïde stam BY4743 (een derivaat van S288C) maar in tegenstelling tot diploïde stam RH2585/2586 (een Σ1278b derivaat) die nauwelijks groeit bij 37°C (Figuur 1A). In die zin is de groei bij 37°C geen bijzondere en unieke eigenschap van S. boulardii. Het is waarschijnlijk eerder een weerspiegeling van zijn aanpassing aan warme klimaten zoals die vaak in Indochina worden aangetroffen.

Een andere onderzochte eigenschap is het potentiële vermogen van S. boulardii om filamenten te vormen. Daartoe werd de bacterie gekweekt op SLAD-platen die slechts beperkte concentraties ammoniumsulfaat bevatten (50 μM, ongeveer 1000 × minder dan het conventionele SD-minimummedium). Zoals waargenomen onder de microscoop vertoont de diploïde stam RH2585/2586 duidelijk filamenteuze eigenschappen onder dergelijke ammoniumbeperkende omstandigheden (Figuur 1B) . Schrapping van het FLO8-gen dat codeert voor een transcriptionele factor die vereist is voor filamentatie en adhesie, deed de filamenteuze eigenschappen volledig verdwijnen. Flo8 is nodig om bijvoorbeeld Flo11, een glycoproteïne op het celoppervlak, tot expressie te brengen. In tegenstelling tot RH2585/2586 vertoonde S. boulardii nauwelijks filamenteuze eigenschappen. Interessant is dat sequencing van het door PCR vermeerderde FLO8 gen van S. boulardii aangaf dat het geen voortijdig stopcodon draagt (niet getoond) dat gevonden wordt in niet-filamenteuze giststammen zoals die afgeleid van S288C . Dus, andere up- of downstream genen die nodig zijn voor filamentatie zijn waarschijnlijk disfunctioneel in S. boulardii. Het gebrek aan filamentatie verklaart waarschijnlijk de lage toxiciteit en het gebrek aan vestigingscapaciteit in het maagdarmkanaal, waardoor het anders meer persistent zou kunnen worden en daardoor problematischer voor medische toepassingen.

Een andere interessante kwestie was het induceren van meiose en sporulatie in S. boulardii om haploïde nakomelingen te verkrijgen. Daartoe werden diploïde cellen geïncubeerd in een vloeibaar medium met limiterend stikstof en een zeer hoge concentratie kaliumacetaat als (arme) koolstofbron. Ondanks verschillende pogingen werd geen tetradvorming waargenomen. In dat opzicht vertoont S. boulardii soortgelijke eigenschappen als RH2585/2586 (de filamenteuze diploïde die in dit werk is gebruikt), die geen tetrads vormt bij behandeling onder de beschreven omstandigheden. Om meiose en sporulatie te induceren, werd een dubbele knock-out van RME1 (Regulator of Meiosis 1) in S. boulardii geproduceerd. RME1 is een negatieve regulator van meiose die de expressie van meiose-vereiste eiwitten zoals IME1 (Inducer of Meiosis 1) verhindert en mitose bevordert. Het S. boulardii ∆∆rme1 derivaat vertoonde geen fenotypische verschillen met de ouderlijke wild-type stam in termen van groeitemperatuur (Figuur 1A). Helaas werden ook van deze knock-outstam geen tetrads verkregen. Ik concludeer dat S. boulardii niet ondergaan meiose en haploïde tetrad vorming althans onder laboratoriumomstandigheden hier gebruikt.

Zoals blijkt uit figuur 1C, S. boulardii draagt geen auxotrofe markers als het groeit goed op minimaal medium (SD) verstoken van aminozuren of nucleïnezuur componenten zoals adenine of uracil. Auxotrofe markergenen konden gemakkelijk worden verkregen door de ADE2- (adeninebiosynthese) of HIS3- (histidinebiosynthese) genen te deleten (figuur 1C). Deze deleties werden verkregen door dominante auxotrofe markergenen in te brengen die resistentie verlenen tegen de antibiotica kanamycine/G418 of nourseothricine. Deletie van een enkele genkopie van ADE2 of HIS3 maakte nog steeds groei op minimale mediumplaten mogelijk (niet getoond), wat duidt op het duidelijke diploïde karakter van deze gist. Alleen dubbele deletie van zowel HIS3- of ADE2-gen kopieën (waardoor het resistent tegen zowel kanamycine/G418 en nourseothricine; Figuur 1C) maakte deze gist stam auxotrophic voor histidine of voor adenine. Nieuw verworven histidine auxotrofie werd gebruikt in een volgend experiment om het te transformeren met gist plasmiden met HIS3 als een selecteerbare marker gen (zie volgende tekst).