DNA-klonering kan spontaan door de cel worden uitgevoerd voor reproductieve doeleinden. Dit is een vorm van ongeslachtelijke voortplanting waarbij een organisme zich in fragmenten splitst en elk van deze fragmenten zich vervolgens ontwikkelt tot volwassen, volgroeide individuen die klonen zijn van het oorspronkelijke organisme (zie reproductieve fragmentatie).DNA-klonen kan ook opzettelijk worden uitgevoerd door laboratoriumonderzoekers. In dit geval is DNA-fragmentatie een moleculair-genetische techniek die onderzoekers in staat stelt recombinant-DNA-technologie te gebruiken om grote aantallen identieke DNA-moleculen te bereiden.Om DNA-klonen te kunnen voltooien, is het noodzakelijk discrete, kleine gebieden van het DNA van een organisme te verkrijgen die specifieke genen vormen. Alleen relatief kleine DNA-moleculen kunnen in een beschikbare vector worden gekloond. Daarom moeten de lange DNA-moleculen waaruit het genoom van een organisme is opgebouwd, worden gesplitst in fragmenten die in het vector-DNA kunnen worden opgenomen. Twee enzymen vergemakkelijken de produktie van dergelijke recombinant-DNA-moleculen:
1. Restrictie-enzymenRestrictie-enzymen zijn door bacteriën geproduceerde endonucleasen die meestal kleine basenpaarreeksen (restrictieplaatsen genoemd) herkennen en vervolgens beide DNA-strengen op deze plaats splitsen. Een restrictieplaats is meestal een palindromische sequentie, wat betekent dat de restrictieplaatssequentie op elke DNA-streng dezelfde is wanneer deze in de 5′-3′-richting wordt gelezen.Voor elk restrictie-enzym produceren bacteriën ook een modificatie-enzym zodat het eigen DNA van een gastheerbacterie wordt beschermd tegen splitsing. Dit gebeurt door het gastheer-DNA op of nabij elke potentiële splitsingsplaats te modificeren. Het modificatie-enzym voegt een methylgroep toe aan een of twee basen, en de aanwezigheid van deze methylgroep voorkomt dat het restrictie-endonuclease het DNA doorknipt.
Veel restrictie-enzymen maken verspringende sneden in de twee DNA-strengen op hun herkenningsplaats, Hierdoor ontstaan fragmenten met een enkelstrengige “staart” die aan beide uiteinden overhangt, een zogenaamd plakkerig uiteinde. Restrictie-enzymen kunnen ook rechte sneden maken in de twee DNA-strengen op hun herkenningsplaats, waardoor stompe uiteinden worden gegenereerd. 2. DNA-ligaseTijdens de normale DNA-replicatie katalyseert DNA-ligase de eind-tot-eindverbinding (ligatie) van korte DNA-fragmenten, de zogenaamde Okazaki-fragmenten. Voor het klonen van DNA wordt gezuiverd DNA-ligase gebruikt om de uiteinden van een restrictiefragment en vector-DNA met complementaire uiteinden covalent aan elkaar te koppelen. Zij worden covalent aan elkaar geligeerd via de standaard 3′ tot 5′ fosfodiësterbindingen van DNA.DNA-ligase kan complementaire plakkerige en stompe uiteinden ligeren, maar ligatie van stompe uiteinden is inefficiënt en vereist een hogere concentratie van zowel DNA als DNA-ligase dan de ligatie van plakkerige uiteinden. Daarom maken de meeste restrictie-enzymen die bij het klonen van DNA worden gebruikt verspringende sneden in de DNA-strengen om kleverige uiteinden te creëren.
De sleutel tot het klonen van een DNA-fragment is het koppelen ervan aan een vector-DNA-molecuul dat zich in een gastheercel kan vermenigvuldigen. Nadat een enkel recombinant DNA-molecuul (bestaande uit een vector plus een ingebracht DNA-fragment) in een gastheercel is gebracht, kan het ingebrachte DNA samen met de vector worden gerepliceerd, waardoor een groot aantal identieke DNA-moleculen wordt gegenereerd.Het basisschema hiervoor kan als volgt worden samengevat:
Vector + DNA-fragment↓ Recombinant DNA↓ Replicatie van recombinant DNA in gastheercel↓ Isolatie, sequenering en manipulatie van gezuiverd DNA-fragment
Er zijn talrijke experimentele variaties op dit schema, maar deze stappen zijn essentieel voor het klonen van DNA in een laboratorium.