Deze studie is gebaseerd op een membraansysteem dat K. R. Porter dierbaar was: het sarcoplasmatisch reticulum (SR) van gestreepte spiervezels. Porter doopte het overvloedige membraansysteem dat de myofibrillen in alle spiercellen dicht en volledig omgeeft toepasselijk als het SR, gebaseerd op zijn plaats (sarcoplasmatisch) en algemene structuur als een uitgebreid netwerk (reticulum). In zijn beschrijvingen van de SR, begonnen in samenwerking met H. S. Bennett (1-3), onderkende Porter twee belangrijke aspecten van dit membraansysteem. Het eerste is dat het SR eenvoudigweg een gespecialiseerde expressie is van het endoplasmatisch reticulum (ER) dat in alle celtypen voorkomt, en het tweede is dat de precieze ligging van het SR ten opzichte van de myofibrillen erop wijst dat het een rol speelt in een bepaald aspect van de controle van de contractiliteit. Beide inzichten van Porter zijn nu volledig bevestigd. Het is bekend dat het SR zich aanvankelijk ontwikkelt als ER dat de gebruikelijke tuinvariëteit aan generieke ER eiwitten bevat en dat, wanneer de spiercel differentieert, het sterk verrijkt raakt in SR-specifieke eiwitten (4, 5). Drie eiwitten die voor het eerst uit het SR werden gezuiverd zijn het calcium ATPase of calcium pomp eiwit dat verantwoordelijk is voor het pompen van calcium in het lumen van het SR tijdens relaxatie (6); calsequestrine, het calcium bindend eiwit met lage affiniteit dat de capaciteit van het SR lumen voor calcium sterk vergroot (7); en de ryanodine receptor (RyR), verantwoordelijk voor het vrijkomen van calcium tijdens spieractivatie (zie ref 8 voor een overzicht). Later werd ontdekt dat alle celtypen celspecifieke vormen en/of analogen van deze drie eiwitten bevatten die verantwoordelijk zijn voor het hanteren van calcium. In alle cellen hebben deze eiwitten de neiging gegroepeerd te zijn. Het SR is dus een uitgebreid, gespecialiseerd domein van het ER van de spiercel. Omgekeerd bevatten alle cellen SR-achtige gespecialiseerde domeinen, maar in veel kleinere hoeveelheden. Sommige niet-spiercellen, zoals de Purkinje cellen van het cerebellum, hebben zelfs uitgebreide SR-achtige domeinen die spier-specifieke isovormen van RyRs en calsequestrine bevatten (9, 10).
Zoals Porter, in zijn onnavolgbare stijl, schreef: specifiek “de precieze morfologische relatie van het reticulum met de myofibrillen…. doet vermoeden dat het systeem functioneel belangrijk is bij spiercontractie.” Inzicht in de specifieke rol van het SR bij het controleren van spiercontractie werd gevormd door kritische publicaties in de spannende periode die onmiddellijk voorafging aan en volgde op Porter’s beschrijvingen van het SR. De lokale stimulatie-experimenten van A.F. Huxley, uitgevoerd aan het eind van de jaren vijftig en het begin van de jaren zestig, wezen op de aanwezigheid van een specifiek pad dat de verspreiding van de elektrische gebeurtenis in het inwendige van de vezel mogelijk maakte en zo een cruciale link legde tussen depolarisatie aan het oppervlak en de snelle activering van centraal gelegen myofibrillen (zie ref 11 voor een overzicht). Het baanbrekende artikel van A. Weber uit 1959 leverde het eerste bewijs dat calciumionen, nu volledig erkend als algemene intracellulaire boodschappers, verantwoordelijk zijn voor de controle van spiercontractie (12). S. Ebashi en A. Weber beïnvloedden elkaar over de continenten heen in het construeren van duidelijke bewijzen dat het calcium-sequestrerend vermogen van de SR de relaxatie volledig verklaart, terwijl W. Hasselbach de SR calcium-pompwerking nauwkeurig definieerde (zie ref 13 voor een overzicht).
Nauwlettend L.D. Peachey in Porter’s laboratorium gevolgd hebbend, was ik mij volledig bewust van de zoektocht, begonnen door A.F. Huxely’s resultaten, naar een verbinding tussen het plasmalemma van de spiervezel en het inwendige ervan, die een snelle verspreiding van de elektrische gebeurtenis in het inwendige van de vezel mogelijk zou maken (14). In hun artikel van 1957 (3) hadden Porter en Palade een zich herhalende structurele eenheid beschreven, de triade, die zich in precieze relatie tot de banden van de myofibrillen bevindt: ofwel tegenover de Z-lijn ofwel tegenover de A-I junctie. De triade bestaat uit 2 SR cisternae die dicht bij een centrale tubulus liggen. De plaats van de triade (3) en van zijn centrale tubulus (15-17) vallen samen met de plaatsen waar de inwaartse verspreiding van contracties ten gevolge van plaatselijke depolarisatie optreedt (11). Andersson-Cedergren (18) toonde met behulp van nauwgezette seriële secties aan dat de centrale elementen van de triade een ononderbroken netwerk vormen dwars door de spiervezels, vandaar de naam transversale (T) tubuli voor deze componenten van de triade. De ogen van elektronenmicroscopisten waren dus gericht op de T tubuli, en ik was klaar voor de ontdekking die mij begroette tegen het einde van mijn postdoctorale opleidingsperiode in het laboratorium van Porter (1963). Ik bekeek dunne secties van skeletspieren van guppy’s die gekweekt waren in de tanks van Elisabeth Porter en zag plotseling herhaaldelijk voorbeelden van wijd openstaande monden van T tubules aan de rand van de vezel. Het was gemakkelijk om Porter’s aandacht te trekken: Ik liep zijn laboratorium binnen om 22.00-11.00 uur, het gebruikelijke einde van zijn werkdag, wanneer hij zich kon ontspannen, en liet hem mijn negatieven zien. Porter’s interesse was onmiddellijk gewekt. Mijn foto’s voldeden niet aan zijn hoge normen, dus nam hij een van mijn blokken, sneed persoonlijk dunne doorsneden, en nam een reeks microfoto’s, elk een kunstwerk (Fig. 1A). Porter’s microfoto’s vormden het merendeel van de illustraties in de uiteindelijke publicatie die aantoonde dat T tubules de essentiële kenmerken hebben die nodig zijn voor hun rol in het verspreiden van membraan depolarisatie aan het oppervlak naar het vezelinterieur (19, zie ook Fig. 1B). Continuïteit van het T tubule lumen met de extracellulaire ruimten werd ook bevestigd in hetzelfde jaar door de penetratie van extracellulaire ruimte tracers (20, 21) en een fluorescerende kleurstof (22). Continuïteit van T tubuli met de oppervlakte membraan ligt aan de basis van de grote oppervlakte membraan capaciteit van spiervezels.
De functionele domeinen van de SR zijn ofwel geassocieerd met de oppervlaktemembraan of met de T tubuli (Fig. 1C, G), en vormen daarmee goed gedefinieerde knooppunten die calcium release units worden genoemd (zie 23, 24 voor reviews). Tijdens excitatie-contractie (e-c) koppeling worden de buitenmembranen aanvankelijk gedepolariseerd, en onmiddellijk daarna laat de SR calcium los in de myofibrillaire ruimten. De structurele vraag wordt dan: wat is de relatie tussen SR en buitenmembranen op deze gespecialiseerde junctionele plaatsen die de vertaling van de elektrische gebeurtenis naar het vrijkomen van calcium uit de SR tijdens spieractivatie mogelijk maakt? Als we ∼25 jaar vooruit springen in de tijd, is de moderne structurele vraag betreffende deze stap in e-c koppeling: wat is de ruimtelijke relatie tussen eiwitten van het SR en van de buitenmembranen in de calcium release units, en wat kan uit deze associatie worden afgeleid? Vier eiwitten van het junctionele SR zijn goed geïdentificeerd: de ryanodine receptoren (RyRs), of SR calcium afgifte kanalen (8); calsequestrine (7, 25); triadin (26); en junctin (27). RyRs zijn homotetramere calciumkanalen die bestaan uit 4 identieke subeenheden met een groot cytoplasmatisch domein en een gecombineerde massa van ∼2.000 kDa, die, wanneer geopend, een snelle ontsnapping van het SR calcium naar de myofibrillaire ruimten mogelijk maken. De cytoplasmatische domeinen van RyRs zijn zichtbaar in de elektronenmicroscoop als voetjes die het junctionele SR oppervlak verbinden met externe membranen (Fig. 1C, D). RyRs zijn dus strategisch geplaatst voor interactie met het oppervlak membraan. Calsequestrine is een luminaal eiwit van de SR cisternae, gelegen in de nabijheid van de junctionele domeinen van het SR (Figs. 1B, C). Zijn functie is het verhogen van de totale calciumcapaciteit van het SR lumen, met behoud van een relatief hoge vrije calciumconcentratie, waardoor een grote gradiënt in ionische calciumconcentratie tussen het SR lumen en de myofibrillen mogelijk wordt. Triadin is waarschijnlijk het eiwit dat calsequestrine aan het SR-oppervlak bindt, waardoor het in de nabijheid van de RyR’s blijft, en junctine kan ook een vergelijkbare rol spelen. Eén van de twee laatstgenoemde eiwitten, of andere die nog moeten worden geïdentificeerd, is verantwoordelijk voor het immobiliseren van calsequestrine in de nabijheid van de calcium-afgavekanalen. Eén membraaneiwit aan het oppervlak bevindt zich bij de junctionele domeinen van buitenmembranen die deelnemen aan calciumafgifte-eenheden (23): het L-type calciumkanaal, ook wel dihydropyridine receptor (DHPR) genoemd. DHPRs fungeren zowel als spanningssensoren als calciumkanalen, en hun werking is noodzakelijk voor het initiëren van calciumafgifte uit het SR (28, 29).
In skeletspieren zijn DHPRs gegroepeerd in tetrads, of groepen van 4 componenten die zich op de hoeken van kleine vierkanten bevinden (Figs. 1E, I). DHPR tetrads vormen geordende arrays die tegenover geordende arrays van de SR voeten staan, zodanig dat elk van de 4 DHPRs die de tetrad samenstellen verbonden lijkt te zijn met een subeenheid van een onderliggende voet (30, 31). Deze directe structurele relatie van de 2 belangrijkste calcium release unit proteïnen ondersteunt de zogenaamde “mechanische” hypothese van e-c koppeling, die voorstelt dat spanningssensoren in het T tubule membraan (waarvan later werd aangetoond dat het de DHPRs zijn) de depolarisatie waarnemen en calcium afgifte uit het SR beïnvloeden door een directe moleculaire interactie (32). Een van de raadselachtige structurele waarnemingen met betrekking tot de DHPR-RyR relatie is dat tetrads geassocieerd zijn met alternatieve voeten (Fig. 1 M), waardoor een set van wees voeten (of RyRs) overblijft die niet direct verbonden zijn met DHPRs. Vergelijkend werk op een verscheidenheid van spieren in vivo en in vitro geeft aan dat de alternate dispositie de regel is voor skeletspieren, en het hangt niet af van de aanwezigheid van 2 soorten RyR isovormen.
Het recente onderzoek naar de moleculaire en ontwikkelingsbasis van de DHPR-RyR relatie is het werk van twee postdoctorale onderzoekers in mijn laboratorium (Drs. Hiroaki Takekura en Feliciano Protasi) en behelst samenwerking met Drs. P. D. Allen, K. G. Beam, B. E. Flucher, en H. Takeshima. De eerste vraag die we hebben onderzocht is hoe de wisselende dispositie van tetrads tot stand komt tijdens de ontwikkeling van de juncties. Deze vraag werd onderzocht in samenwerking met Dr. B. E. Flucher met behulp van cellen van skeletspier oorsprong in de BC3H1 cellijn, die geco-lokaliseerde clusters van DHPRs, triadin en RyRs ontwikkelen aan de cel periferie (33). Dunne secties en vriesfracturen van deze cellen tonen goed gedifferentieerde calcium release units die uitgebreide geordende arrays van voetjes en tetrads bevatten. De tetrads hebben een wisselende dispositie. Veel van de knooppunten hebben tetrads met ontbrekende elementen, en omdat we deze vinden in zowel vroege als late dagen in cultuur, nemen we aan dat veel knooppunten vertegenwoordigen in het proces van vorming. Interessant is dat arrays van tetrads, zelfs als ze incompleet zijn, een andere dispositie hebben dan arrays van voetjes, wat erop wijst dat deze relatie intrinsiek is aan de interacties tussen de 2 eiwitten.
De tweede vraag is of de groepering van DHPRs in tetrads uniek is voor skeletspieren of aanwezig is in spieren die een andere basis voor e-c koppeling lijken te hebben. Hartspieren bevatten isovormen van RyRs en DHPRs die verschillen van die van skeletspieren, en ze verschillen functioneel in die zin dat permeatie van calcium door de DHPRs een vereiste lijkt te zijn voor e-c koppeling (34, 35). DHPRs en RyRs van hartspieren bevinden zich op plaatsen die co-lokaliseerbaar lijken op lichtmicroscoop niveau (Fig. 1F), net als in skeletspieren, en deze juxtapositie wordt vroeg in de differentiatie van het e-c koppelingsapparaat bereikt (36-38). Vries-fractuur, echter, toont aan dat de DHPRs dispositie in hartspier is verschillend van die in skeletspier (vergelijk Figs. 1I, K). De DHPRs bevinden zich in de nabijheid van de voeten, maar lijken er niet direct mee verbonden te zijn (Fig. 1N), zodat hun interactie indirect kan zijn, via een transmitter (b.v. calcium).
De bovenstaande informatie is direct relevant voor het begrijpen van 2 muismodellen voor de studie van e-c koppeling. In het ene model ontbreekt de belangrijkste (α1) subeenheid van de skeletale DHPRs. De spieren trekken niet samen door een gebrek aan e-c koppeling en ontwikkelen zich slecht (vandaar de term dysgeen). Er worden echter wel triades gevormd met arrays van pootjes, wat aangeeft dat de aanwezigheid van RyRs niet nodig is voor de vorming van SR-oppervlakte juncties. Clusters van DH-PRs (gedetecteerd door immunolabeling) en DHPR tetrads (gedetecteerd door vriesfractuur) ontbreken in dysgene spiercellen, maar ze worden hersteld door transfectie van gekweekte dysgene myotubes met cDNA voor de DHPR, wat aantoont dat tetrads zijn opgebouwd uit DHPRs (31, 39, 40). Het andere model is een gerichte null mutatie van het skelet type RyR, wat ook resulteert in blokkade van e-c koppeling. Spiervezels zonder RyR vormen, onverwacht, triades (41) (Fig. 1H). De triades hebben geen voeten, vandaar de term dyspedisch, maar zien er verder normaal uit in dunne doorsneden. Een cellijn (1B5) ontwikkeld uit een dyspedic mutatie mist ook e-c koppeling. Met behulp van deze cellen hebben we aangetoond dat ondanks de afwezigheid van voeten, dyspedische SR-oppervlakte juncties worden gevormd en triadin en DH-PRs bevatten (42). Echter, in vries-fractuur de clusters van DHPRs gelegen op dyspedic knooppunten niet aggregeren in tetrads (Fig. 1L). Expressie van cDNA coderend voor de skeletspier type 1 RyR in 1B5 cellen resulteert in de vorming van perifeer gelegen RyR spots (Fig. 1P) en in de clustering van DHPR in tetrads (Fig. 1Q). DHPRs hebben dus niet de aanwezigheid van RyRs nodig om te clusteren op SR-oppervlakte junctionele plaatsen, maar ze hebben wel een interactie met skelet RyRs nodig om tetrads te vormen. Dit bevestigt ook indirect dat er een verband bestaat tussen RyR en DHPRs in skeletspiervezels. Omgekeerd wijst het ontbreken van tetrads in hartspieren erop dat ofwel een RyR-DHPR link niet aanwezig is ofwel dat de link anders is dan die in skeletspieren. Zowel de aanwezigheid van de RyR-DHPR link als de afwezigheid of het verschil ervan hebben diepgaande functionele implicaties voor de e-c koppeling. K.R. Porter zou deze ontwikkelingen in ons begrip van de SR hebben goedgekeurd, omdat zij gebaseerd zijn op nauwkeurig definieerbare structuur-functie relaties.