Kalibratiekrommen worden gebruikt om inzicht te krijgen in de instrumentele respons op een analyt, en om de analytconcentratie in een monster te voorspellen.
Een kalibratiekromme wordt gemaakt door eerst een reeks standaardoplossingen te bereiden met bekende concentraties van de analyt. De respons van het instrument wordt voor elke oplossing gemeten en uitgezet tegen de concentratie van de standaardoplossing. Het lineaire gedeelte van deze grafiek kan dan worden gebruikt om de concentratie van een monster van de analyt te voorspellen, door de respons te correleren met de concentratie.
Deze video introduceert kalibratiecurven en hun gebruik, door de bereiding van een reeks standaardoplossingen te demonstreren, gevolgd door de analyse van een monster met onbekende concentratie.
Een reeks standaardoplossingen wordt gebruikt om de kalibratiecurve te bereiden. Deze oplossingen bestaan uit een reeks concentraties die bij benadering overeenkomen met de concentratie van de analyt.
Standaardoplossingen worden vaak bereid met een seriële verdunning. Een seriële verdunning wordt uitgevoerd door eerst een stockoplossing van de analyt te bereiden. De stockoplossing wordt vervolgens verdund met een bekende hoeveelheid, vaak een orde van grootte. De nieuwe oplossing wordt vervolgens op dezelfde wijze verdund, enzovoort.
De ijkkromme is een grafiek van het instrumentele signaal en de concentratie. Het diagram van de standaards moet lineair zijn en kan worden aangepast met de vergelijking y=mx+b. De niet-lineaire gedeelten van de plot moeten buiten beschouwing worden gelaten, omdat deze concentratiebereiken buiten de lineariteitsgrens liggen.
De vergelijking van de best passende lijn kan dan worden gebruikt om de concentratie van het monster te bepalen, door het signaal van het instrument te correleren met de concentratie. Monsters met metingen die buiten het lineaire bereik van de plot liggen, moeten worden verdund, om binnen het lineaire bereik te komen.
De aantoonbaarheidsgrens van het instrument, of de laagste meting die statistisch over de ruis kan worden bepaald, kan ook uit de ijkcurve worden berekend. Een blancomonster wordt meerdere malen gemeten. De aantoonbaarheidsgrens wordt in het algemeen gedefinieerd als het gemiddelde blancosignaal plus driemaal de standaardafwijking.
Tot slot kan ook de bepaalbaarheidsgrens worden berekend. De bepaalbaarheidsgrens is de laagste hoeveelheid analyt die nauwkeurig kan worden gekwantificeerd. Deze wordt berekend als 10 standaarddeviaties boven het blanco signaal.
Nu u de grondbeginselen van een ijkcurve hebt geleerd, laten we eens kijken hoe u er een in het laboratorium kunt bereiden en gebruiken.
Vooreerst bereidt u een geconcentreerde stamoplossing van de standaard. Weeg de standaard nauwkeurig af en breng hem over in een maatkolf. Voeg een kleine hoeveelheid oplosmiddel toe en meng zodat het monster oplost. Vul vervolgens tot de streep met oplosmiddel. Het is belangrijk hetzelfde oplosmiddel als het monster te gebruiken.
Om de standaarden te bereiden, pipetteert u de benodigde hoeveelheid in de maatkolf. Vul vervolgens de maatkolf tot de streep met oplosmiddel en meng.
Doorgaan met het maken van de standaarden door te pipetteren uit de stockoplossing en te verdunnen. Voor een goede ijkcurve zijn ten minste 5 concentraties nodig.
Draai nu monsters met het analytische instrument, in dit geval een UV-Vis spectrofotometer, om de instrumentele respons te bepalen die nodig is voor de ijkcurve.
Met de eerste standaard wordt gemeten. Voer de standaarden in willekeurige volgorde uit, voor het geval er systematische fouten optreden. Meet elke standaard 3-5x om een schatting van de ruis te krijgen.
Met de rest van de standaarden, waarbij de metingen voor elke standaard worden herhaald. Noteer alle gegevens.
Draai ten slotte het monster. Gebruik dezelfde monstermatrix en meetcondities als bij de standaards. Zorg ervoor dat het monster binnen het bereik van de standaarden en de limiet van het instrument ligt.
Om de kalibratiecurve te construeren, gebruikt u een computerprogramma om de gegevens als signaal versus concentratie uit te zetten. Gebruik de standaardafwijking van de herhaalde metingen voor elk gegevenspunt om foutbalken te maken.
Verwijder delen van de curve die niet-lineair zijn, voer dan een lineaire regressie uit en bepaal de best passende lijn. Het resultaat moet een vergelijking zijn van de vorm y = m x + b. Een R2-waarde in de buurt van 1 duidt op een goede fit.
Dit is de kalibratiecurve voor blauwe kleurstof nr. 1, gemeten bij 631 nm. De respons is lineair tussen 0 en 15 mM.
Bereken de concentratie van het monster met behulp van de vergelijking van de best passende lijn. De extinctie voor het monster was 0,141, en kwam overeen met een concentratie van 6,02 mM.
Nu u hebt gezien hoe een kalibratiecurve kan worden gebruikt met een UV-Vis spectrofotometer, laten we eens kijken naar enkele andere nuttige toepassingen.
Kalibratiecurven worden vaak gebruikt bij elektrochemische toepassingen, omdat het signaal van de elektrode moet worden gekalibreerd aan de concentratie van ionen in de oplossing. In dit voorbeeld zijn gegevens verzameld voor een ion-selectieve elektrode voor fluoride.
De concentratiegegevens moeten worden uitgezet op de log-schaal om een lijn te verkrijgen. Deze kalibratiecurve kan worden gebruikt om de concentratie fluoride in een oplossing, zoals tandpasta of drinkwater, te meten.
High-performance liquid chromatography, of HPLC, is een scheidings- en analysetechniek die veel wordt gebruikt in de analytische chemie. HPLC scheidt de componenten van een mengsel op basis van de tijd die de moleculen nodig hebben om de lengte van de chromatografiekolom af te leggen. Deze tijd varieert afhankelijk van een reeks chemische eigenschappen van de moleculen.
De elutie van de moleculen wordt gemeten met behulp van een detector, wat resulteert in een chromatogram. Het piekoppervlak kan worden gecorreleerd aan de concentratie met behulp van een eenvoudige ijkkromme van een reeks standaardoplossingen, zoals in dit voorbeeld van populaire frisdrankingrediënten.
In sommige gevallen, wanneer de oplossingsmatrix interfereert met de meting van de opgeloste stof, kan een klassieke ijkkromme onnauwkeurig zijn. In die gevallen wordt een aangepaste ijkcurve gemaakt. Hiertoe wordt een reeks standaardvolumes van de oplossing aan het monster toegevoegd. Er wordt een signaal-concentratiegrafiek gemaakt, waarbij het x-afsnijpunt gelijk is aan de oorspronkelijke concentratie van de monsteroplossing. Voor meer details over deze techniek, bekijk de JoVE wetenschapseducatie video, “De methode van standaardadditie”.
Je hebt zojuist JoVE’s inleiding tot de kalibratiecurve bekeken. Je zou nu moeten begrijpen waar de kalibratiecurve wordt gebruikt, hoe je hem maakt, en hoe je hem kunt gebruiken om concentraties van monsters te berekenen.
Zoals altijd, bedankt voor het kijken!