Heading

RESULTATEN

21-daagse inhalatiestudies waarin gewone rook en zijstroomrook worden vergeleken

De eerste studie van zijstroomrook bij INBIFO, studie 3047,13-16 was een 21-daagse inhalatiestudie die in november 1981 van start ging. Mannelijke Sprague Dawley-ratten werden blootgesteld aan gelijke concentraties (gebaseerd op de totale deeltjesmassa (TPM) per liter) van gewone sigarettenrook, zijstroomrook van een sigaret die werd gepuft volgens het protocol van de Federal Trade Commission (FTC),17 en zijstroomrook van een vrij brandende sigaret.14 Omdat verse zijstroomdeeltjes van sigarettenrook een massamediane aërodynamische diameter van 0,23 μM hebben,18 zijn moderne deeltjesmetingen van PM2.5 en PM3.5 gelijkwaardig aan de door INBIFO gebruikte TPM-metingen.

De rookconcentratie was 170 μg/l TPM (170 000 μg/m3), ongeveer een derde van de maximaal getolereerde dosis die door INBIFO’s eerdere inhalatiestudies met gewone rook was vastgesteld.19,20 Twintig ratten in elke blootstellingsgroep werden gedurende 21 dagen zeven uur per dag blootgesteld aan de rook. De blootstellingsmethode was “head only”, wat betekent dat de ratten met hun kop eerst in nauwsluitende plastic buizen werden geplaatst met een afgeschermd hoofdgedeelte dat uitstak in een kanaal waardoor de rokerige lucht stroomde. Controles voor het experiment bestonden uit ratten die in hun normale kooien werden gehouden (kooicontroles) en ratten die in blootstellingsbuizen werden geplaatst maar verse lucht kregen om in te ademen (schijnblootstelling).

Niemand van de controleratten stierf, één rat van de reguliere blootstellingsgroep stierf, 11 ratten van de gepofte zijstroomgroep stierven of werden gedood in een stervende toestand, en 12 ratten van de vrij brandende zijstroomgroep stierven of werden gedood in een stervende toestand14 (tabel 1). Aan het einde van de dagelijkse blootstellingen, was de gemiddelde lichaamstemperatuur 37°C voor de aan sham en kooi controle blootgestelde ratten, 36°C voor de aan mainstream blootgestelde ratten, en 32°C voor de aan sidestream blootgestelde ratten14 (tabel 1). De toename in sterfte geeft aan dat de zijstroom rook acuter toxisch was en de daling van de lichaamstemperatuur suggereert shock en een verminderde metabolische functie bij de aan zijstroom blootgestelde ratten.21

De ademhalingsfrequentie van de sham- en kooicontrolegroepen was 107 ademhalingen/min, van de aan de hoofdstroom blootgestelde ratten 91 ademhalingen/min, en van de aan de zijstroom blootgestelde ratten 86 ademhalingen/min.14 De sham en de kooi-controle ratten namen in gewicht toe gedurende de 21 dagen blootstelling tot ongeveer 150% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht; de aan de hoofdstroom blootgestelde groep bereikte 130% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht; de aan de zijstroom blootgestelde groepen verloren gewicht, dalend tot 80% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht14 (tabel 1). De verminderde lichaamsgewichten werden geassocieerd met verminderde voedselconsumptie en suggereren shock en cachexie.21

Na 21 dagen blootstelling vertoonde 6% van de aan de hoofdstroom blootgestelde ratten lichte atrofie van het reukepitheel, en 13% vertoonde lichte basale celhyperplasie van het gecilieerde epitheel in de neusholte. Alle aan zijstroom blootgestelde ratten vertoonden uitgesproken atrofie of ulceratie van het reukepitheel en zowel hyperplasie als plaveiselcelmetaplasie van het gecilieerde epitheel in de neusholte, met verhoorning in sommige gevallen (tabel 1). De onderzoekers concludeerden: “zijstroom blootstelling induceerde vaker en ernstiger epitheliale laesies in het olfactorische en gecilieerde epitheel van de neusholte dan de mainstream. Als men extrapoleert uit de ervaring van eerdere inhalatiestudies met mainstream-rook, zou de totale concentratie bepaald materiaal van deze studie met een factor drie moeten worden verhoogd om soortgelijke sterke reacties te veroorzaken als bij de zijstroomblootstelling in deze studie. “14

Tussen 1982 en 1985 werden in totaal zeven inhalatiestudies van 21 dagen uitgevoerd waarin mainstream- en zijstroomrook werden vergeleken (3057,35-37 3061,20,22-24 3069,25-29 3081,30-33 3108,38 311339,40). In vier van deze studies (3057, 3061, 3069, 3081) werden rookconcentraties gebruikt die voldoende waren om 10% of meer van de ratten te doden (tabel 1). Gewichtsverlies en rectale temperatuur lager dan 33,5°C waren gecorreleerd met sterfte. Gemiddeld over de vier studies veroorzaakte zijstroomrook vergelijkbare sterftecijfers bij een derde van de concentratie (140 μg/l TPM) van gewone rook (469 μg/l).

De technici die de dieren behandelden merkten ook andere, meer subtiele, tekenen op van de vergelijkende toxiciteit van zijstroom sigarettenrook. In studie 3061 werd een TPM-dosis van 380 μg/l vergeleken met een dosis van 90 μg/l uit de zijstroom. De dierenverzorgers merkten op: “alle met rook behandelde ratten vertoonden algemene tekenen van uitputting na het einde van de dagelijkse blootstelling. In tegenstelling tot alle andere ratten die herstelden tot de volgende ochtend, bleven de ratten van de hoogste sidestream groep een ruige vacht en een licht gedaalde rectale temperatuur vertonen. “24 Deze factoren samen in overweging nemend, verklaarden de auteurs van de integrerende rapporten voor studies 3069 en 3081: “De aan mainstream en hoge dosis sidestream blootgestelde groepen reageerden ongeveer gelijk, hoewel de TPM concentratie in de aan hoge dosis sidestream blootgestelde groep ongeveer een factor vier lager was dan in de aan mainstream blootgestelde groep. “25,41

De resultaten van het histopathologisch onderzoek van de respiratoire epithelia ondersteunen het idee dat sidestream rook per gram vier keer giftiger is dan mainstream rook. Vergeleken op basis van TPM, was de concentratie van zijstroomrook die voldoende was om necrose van het epitheel dat de neusholte bekleedde te veroorzaken 23% van die van gewone rook (tabel 1). De concentratie van zijrook die voldoende was om atrofie van het reukepitheel te veroorzaken was een tiende van die van gewone rook en de concentratie van zijrook die voldoende was om squameuze metaplasie van het neusepitheel te veroorzaken was een derde (tabel 1).

In maart 1982 vergeleken INBIFO onderzoekers gewone en zijrookcondensaten (verzameld in een impactieval) in een bacteriële mutagenese test (306742). Zij gebruikten de plaatinbouwtest met S9-microsomen en twee stammen van Salmonella typhimurium, TA 98 (waarmee frameshiftmutaties worden gedetecteerd) en TA 100 (waarmee vervanging van DNA-basenparen wordt gedetecteerd). Stam TA 98 vertoonde geen verschil, maar stam TA 100 vertoonde 30% hogere activiteit met sidestream condensaat. Deze resultaten suggereren dat sidestream condensaat en zijn metabole afbraakproducten meer basenpaarvervangingen per gram induceren dan mainstream condensaat.

Tumorigenese

In 1982 werd sidestream rookcondensaat opgenomen in een 80 weken durend huidschilderingstumorigenese-experiment op muizen (306843-45). De helft van de muizen kreeg een eenmalige voorbehandeling met 7,12 dimethylbenz(α)antraceen (DMBA), de andere helft niet. Chemische verbindingen zoals DMBA, die op zichzelf voldoende zijn om tumoren te veroorzaken, worden tumorinitiatoren genoemd. Chemische verbindingen die op zichzelf geen tumoren veroorzaken, maar die de incidentie of multipliciteit van tumoren verhogen wanneer ze worden toegepast na een tumorinitiator, worden tumorpromotoren genoemd. De toegediende doses sigarettenrookcondensaat waren 60, 90, of 120 mg per muis per week.

Tekenen van intoxicatie (hectische activiteit, buikligging, hijgen, gesloten ogen) waren meer uitgesproken bij de met sidestream behandelde muizen en hielden langer aan. Alleen het sidestream condensaat veroorzaakte een dosisafhankelijke mortaliteit45 (tabel 2). Bij de muizen die niet met DMBA werden behandeld, was de incidentie van tumoren 3,4-5 maal hoger bij de muizen die met sidestream condensaat werden behandeld dan bij de muizen die met mainstream condensaat werden behandeld (tabel 2), wat suggereert dat sidestream condensaat een veel krachtiger tumorinitiator is dan mainstream condensaat. Rekening houdend met de tijd tot de ontwikkeling van de tumor, de incidentie van de tumor, en de multipliciteit van de tumor, concludeerden de INBIFO-onderzoekers dat sidestream condensaat, zonder DMBA-behandeling, 2-6 keer tumorigener was dan mainstream condensaat en dat sidestream condensaat, voorafgegaan door DMBA-behandeling, 2-3 keer tumorigener was dan mainstream condensaat.43

Aute toxiciteit

Het eerste onderzoek naar acute toxiciteit (307146,47) vergeleek eenmalige toediening van condensaat van sigarettenrook uit de hoofdstroom en zijstroom, variërend van 100-2115 mg/kg lichaamsgewicht, bij muizen.48 De muizen werden gedurende twee weken na het aanbrengen van het condensaat bestudeerd. De LD50-concentratie (concentratie die volstaat om bij 50% van de dieren de dood te veroorzaken) voor zijstroomcondensaat was 608 mg/kg. De met mainstream condensaat beschilderde dieren bereikten tijdens het onderzoek geen 50% sterfte, maar de geëxtrapoleerde LD50 bedroeg 2370 mg/kg. De sidestream LD50 voor blootstelling van de huid was ongeveer een derde van de mainstream LD50.

Studie 3099,47 een toxiciteitstest op menselijke longweefselkweekcellen, toonde ook het verschil in toxiciteit tussen mainstream en sidestream rook aan. De cellen werden in confluente monolayers uitgezaaid, kregen een nacht de tijd om te hechten en werden blootgesteld aan verse rook.49 De rook werd in wisselende concentraties in de afgesloten luchtruimte boven de longcellen en het kweekmedium gepompt en een nacht vastgehouden, waarna de cellen uit de kolven werden losgemaakt en de volgende ochtend op levensvatbaarheid werden getest. De LD50 voor zijstroomrook was een derde van die voor gewone rook.49

In 1984 begon het onderzoek naar zijrook zich te richten van acute toxicologische effecten en tumorigenese naar het testen van de effecten op specifieke celtypes en cellulaire systemen in een poging om te bepalen welke chemische componenten zijrook uniek irriterend maakten, en om een geen waarneembaar effect niveau (NOEL) te vinden voor het inademen van zijrook.

Witte bloedcellen

Drie studies testten het effect van rookinhalatie op de witte bloedcelpopulaties in de long (3108,38 3113,39,40 501550). Inhalatie van mainstream- en sidestream-rook had niet zo merkbaar verschillende effecten op deze cellen als op het respiratoire epitheel. Beide soorten rook verhoogden het aantal polymorfonucleaire leukocyten en pulmonale alveolaire macrofagen die uit de longen werden teruggevonden,38 maar verminderden het aantal totale leukocyten die uit het bloed werden teruggevonden.39 Lymfocyten die werden teruggevonden uit de longen van dieren die aan de hoofdstroom waren blootgesteld, hadden een iets hogere mate van door mitogene proliferatie geïnduceerde proliferatie dan die van dieren die aan de zijstroom waren blootgesteld.50 Lymfocyten die werden teruggevonden van dieren die aan de zijstroom waren blootgesteld, waren minder levensvatbaar dan die van dieren die aan de hoofdstroom waren blootgesteld.38,50 De bevindingen van verminderde levensvatbaarheid van lymfocyten suggereren dat de immuuncapaciteit van de dieren blootgesteld aan sidestream rook verminderd zou kunnen zijn in vergelijking met die van de dieren blootgesteld aan mainstream rook.51

Chemische basis voor verhoogde sidestream toxiciteit

De eerste studie die de chemische basis onderzocht voor het verschil tussen mainstream en sidestream rook vergeleek sidestream rook en ammoniakdamp in een eendaags inhalatie-experiment met ratten (310452-54). Zijstroomrook bevat tussen 15 en 300 maal meer ammoniak dan gewone rook. In de inleiding van rapport 3104 staat: “ammoniak werd verwacht als een van de belangrijkste irriterende bestanddelen van zijstroomrook. “52 Er werden vijf concentraties zijstroomrook getest, variërend van 13-253 μg/l TPM. De vijf geteste ammoniakdampconcentraties varieerden van 51 μg/l (ongeveer de ammoniak in 253 μg/l TPM zijstroom) tot 414 μg/l (ongeveer 10× de ammoniak in 253 μg/l TPM zijstroom).

Twaalf van de 20 ratten die werden blootgesteld aan de hoogste zijstroomconcentratie stierven. Geen van de ratten in de ammoniak groepen stierf.52 Gemiddeld over de gehele zeven uur, was de ademfrequentie van de ratten in de hoogste dosis zijstroom groep minder dan de helft van die van de sham controles. De ademhalingsfrequentie van de ratten in de hoogste dosis ammoniak was gelijk aan die van de sham controles.52 Bij de hogere sidestream concentraties daalde de lichaamstemperatuur van de ratten gestaag gedurende de zeven uur blootstelling, van 37°C tot 30°C, maar de temperatuur van de ammoniak groepen veranderde niet. De INBIFO-wetenschappers concludeerden dat zijstroomrook 10 keer irritanter is dan de ammoniakdamp die hij bevat.52

Studie 506155 was een vervolg op studie 3104. Daarin werden de effecten getest van vijf chemische stoffen die in hoge concentraties in zijrook voorkomen – formaldehyde, acetaldehyde, acroleïne, ammoniak en isopreen – bij een blootstelling van drie dagen waarbij de hoeveelheid door de ratten uitgeademde kooldioxide werd gemeten.55 Veranderingen in de hoeveelheid uitgeademde kooldioxide duiden op veranderingen in zowel de ademhalingsfrequentie als het ademteugvolume. Verlaagde ademhalingsfrequentie en oppervlakkige ademhalingen zijn reacties op zintuiglijke irritatie.56 Uit de studie bleek dat de combinatie van alle vijf verbindingen, in de concentraties waarin ze voorkomen in zijrook, slechts 10-20% zo irriterend was als volledige zijrook.55

De volgende studie (312457-61) waarin de chemische basis voor de toxiciteit van zijrook werd onderzocht, vergeleek de effecten van volledige zijrook, de deeltjesfase van zijrook, de gas- en dampfase van zijrook, en een gerecombineerde zijrook bestaande uit de deeltjesfase en de gas- en dampfase. Ratten werden gedurende drie dagen zeven uur per dag blootgesteld aan de verschillende rooksoorten. Ademhaling, irritatiesymptomen, lichaamstemperatuur en lichaamsgewicht werden gecontroleerd, waarna de ratten werden gedood en hun luchtwegen werden onderzocht.

De rook van de volledige zijstroom was het meest irriterend, gevolgd door de gas/dampfase, de gerecombineerde rookfase, en tenslotte de deeltjesfase.58 De gas/dampfase had een veel sterker effect op het epitheel dat de luchtwegen bekleedt dan de deeltjesfase.60 De incidentie van hyperplasie en metaplasie was hoger bij de dieren die aan de gas/dampfase werden blootgesteld dan bij de dieren die aan de deeltjesfase werden blootgesteld.60 De enige plaats in de luchtwegen waar de deeltjesfase meer schade aanrichtte dan de gas/dampfase was de voorste larynx,60 mogelijk omdat de voorste larynx bij de rat een belangrijke plaats is waar ingeademde deeltjes terechtkomen.62

Experiment 506263 vergeleek de effecten op het bovenste respiratoire epitheel van hele zijstroomrook, zijstroom gas/dampfase en een mengsel van formaldehyde, acroleïne en ammoniak in twee keer de concentratie waarin deze verbindingen aanwezig zijn in de hele zijstroomrook. Het mengsel veroorzaakte ongeveer 35% van de schade veroorzaakt door de gehele zijstroom rook.63

Experiment 312664-66 vergeleek zijstroom rook van 2R1 sigaretten met zijstroom van een niet-tabak sigaret, zijstroom van de niet-tabak sigaret met toegevoegde nicotine, en aërosols van zuivere nicotine, formaldehyde, acetaldehyde, acroleïne, en ammoniak. De concentraties van de aërosolen van afzonderlijke chemicaliën werden zo geschaald dat de hoogste concentratie ongeveer twee keer zo hoog zou zijn als de concentratie van die component in 2R1 rook.

De eindpunten die werden onderzocht waren gewichtstoename, kooldioxide (CO2) uitademing, en histopathologie van de luchtwegen. 2R1 rook verminderde de gewichtstoename het meest, gevolgd door de niet-tabak sigaret met toegevoegde nicotine, de niet-tabak sigaret, dan zuivere nicotine en acroleïne.66 2R1 rook en nicotine, bij hun hoogste concentraties, verlaagden de lichaamstemperatuur met respectievelijk 5°C en 3,5°C.66 De middelste en hoogste concentraties van 2R1-rook verminderden de CO2-uitademing met ongeveer 50%.66 De hoogste concentratie zuivere nicotine verminderde de CO2-uitademing met ongeveer 20%.66 Acroleïne-aerosol had 20-25% van het effect van 2R1-rook op de histopathologie van het ademhalingsepitheel.64 In het strottenhoofd veroorzaakte de hoogste acroleïne-aerosolconcentratie bijna evenveel verdikking van het epitheel als de 2R1-rook.64 Formaldehyde, aceetaldehyde en ammoniak hadden geen effecten. Alles bij elkaar tonen deze experimenten aan dat, hoewel acroleïne en nicotine een deel van de effecten van zijrook kunnen verklaren, de rook in zijn geheel giftiger is dan de som van de effecten van zijn hoofdbestanddelen.

Geen waarneembare effectniveaus

Een reeks experimenten begon in 1985 die bedoeld was om verschillende blootstellingsmethoden te vergelijken en een NOEL te vinden voor blootstelling op korte termijn (21-90 dagen) aan verse zijrook, waarbij concentraties van 2-20 μg/l TPM en drie verschillende methoden van rookblootstelling werden gebruikt. De in studie 311467,68 gebruikte methode was uitsluitend kop, de standaardmethode die in alle voorgaande experimenten werd gebruikt. In de studies 312569 en 312770 werd alleen blootstelling aan de neus gebruikt. Deze aanpak vereiste een meer restrictieve blootstellingskamer en resulteerde in meer stress bij de dieren. De schijn-blootgestelde ratten, opgesloten in blootstellingsbuizen met uitsluitend een neus en frisse lucht om in te ademen, wogen 20% minder dan de kooi-controleratten. In studie 312334,71-73 werd gebruik gemaakt van een blootstelling van het gehele lichaam. In het blootstellingssysteem voor het hele lichaam werden de dieren blootgesteld aan rook terwijl ze in hun kooien zaten, vrij bewegend in groepjes van twee, in plaats van alleen opgesloten te zitten in een blootstellingsbuis.

Studie 311467,68 testte zijstroomrook bij 3, 5, en 17 μg/l TPM. De ratten werden verdeeld in twee groepen, één kreeg de rook gedurende 3,5 uur/dag en de andere gedurende 7 uur/dag. Zij testten ook de effecten van een herstelperiode van 14 dagen na de blootstelling aan rook. Op basis van de resultaten stelden de INBIFO-wetenschappers verschillende NOEL’s voor elke plaats in de bovenste luchtwegen voor: 2 μg/l voor hyperplasie van de reservecellen van het epitheel in de neus, 17 μg/l voor verhoorning van het epitheel in de neus en atrofie van het reukepitheel, en tussen 2-17 μg/l voor hyperplasie van het epitheel van de stembanden, afhankelijk van de precieze plaats in de stembanden (tabel 3). (Deze niveaus zijn geen echte NOEL’s, aangezien sommige effecten nog steeds werden waargenomen.) Alle waargenomen veranderingen van het respiratoire epitheel veroorzaakt door 21 dagen inhalatie waren omkeerbaar na 14 dagen herstel.

In studie 312334,71-73 werden de effecten van hogere concentraties zijstroomrook (20 en 60 μg/l TPM) gemeten met behulp van een blootstellingsysteem voor het gehele lichaam. De technici die verantwoordelijk waren voor het handhaven van de rookconcentratie op de gespecificeerde niveaus namen monsters van de rook vlak voordat deze in de kooien werd vrijgelaten en van binnenuit de kooien, en merkten dat: “De ‘echte’ concentraties in de kooien waren lager dan die welke bij de inlaat werden bepaald met de factor 0,8-0,9 voor TPM, 0,6 tot 0,8 voor nicotine, 0,3 voor ammoniak en 0,4 tot 0,5 voor formaldehyde. Voor de andere componenten was de factor bijna één. “71 De lagere concentraties van sommige rookcomponenten werden weerspiegeld in minder ernstige schade aan de luchtwegen.72 Ondanks de lage rookconcentraties en de niet-beperkende blootstellingskamers vertoonden de aan rook blootgestelde ratten nog steeds een afname in gewichtstoename van ongeveer 15%71 (tabel 3).

Studies 312569 (21 dagen) en 312770 (90 dagen) testten 2 μg/l en 6 μg/l TPM met uitsluitend blootstelling via de neus. Bij de blootstelling van 21 dagen veroorzaakte geen van beide concentraties hyperplasie in het neusepitheel en de concentratie van 6 μg/l veroorzaakte hyperplasie en lichte metaplasie in de stembanden (tabel 3), evenals een afname van de gewichtstoename met 12% voor de lage concentratie en 24% voor de hoge concentratiegroep.74 In de studie van 90 dagen veroorzaakten beide doseringen hyperplasie in het neusepitheel en de stembanden70 (tabel 4), maar er was geen effect op de gewichtstoename. Bij 6 μg/l TPM gedurende 90 dagen was er significante metaplasie aan de stembanden. De schade aan het respiratoire epitheel was bij beide concentraties ernstiger en kwam meer voor na 90 dagen dan na 21 dagen70 (tabel 4), hetgeen aantoont dat langere blootstelling aan zijstroomrook ernstiger schade aan de luchtwegen veroorzaakt.