Abstract
Vele patiënten ervaren een uitstekend lichamelijk herstel na een operatie; maar er zijn ook patiënten die last hebben van stemmingswisselingen, zelfs depressie. Postoperatieve depressie kan het gevolg zijn van cognitieve disfunctie, pijn, en een gecompromitteerd immuunsysteem tijdens de operatie. Maar er is een grotere kans dat algemene anesthesie verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van depressie. Hier hebben we een van de meest gebruikte anesthetica, propofol, gebruikt in een muismodel om te onderzoeken of deze intraveneuze anesthetische verbinding depressieve gedragspatronen kan veroorzaken bij muizen. Wij vonden dat een enkele dosis propofol significant afwijkend gedrag veroorzaakte in staart suspensie, geforceerd zwemmen, en open veld testen. We onderzochten ook de hersendoorsnede van deze muizen en ontdekten dat er een significant verminderde expressie was van het CD11b eiwit, wat een remming van propofol op de microgliale functie aantoonde. We onderzochten het effect van propofol op synaptisch eiwit, SYP, en ontdekten dat er geen merkbare invloed was op de expressie van het eiwit. Deze resultaten suggereren dat de behandeling met propofol depressieve gedragingen bij muizen kan bevorderen via beïnvloeding van de microgliale celfunctie. Bovendien vonden we dat het niveau van de IL-6 cytokine significant verhoogd was in het hersenweefsel, wat vervolgens de activering van de transcriptiefactor, STAT3, zou kunnen veroorzaken. Onze bevindingen kunnen een nieuw perspectief bieden voor het verder begrijpen van het mechanisme van anesthesiemedicijnen en het ontcijferen van het onderliggende mechanisme van postoperatieve depressie.
1. Inleiding
Veel patiënten die algehele anesthesie of een operatie ondergaan, ervaren een vorm van postoperatieve depressie, vooral gedurende de zes maanden na een invasieve ingreep. Als een van de frequente complicaties na een operatie, kan depressie leiden tot verdere morbiditeit en mortaliteit, vooral bij oudere patiënten. Ondertussen hebben onderzoekers ontdekt dat depressieve patiënten meer kans hebben op andere complicaties na de operatie . Ze zijn minder goed in staat om goed samen te werken met de zorgverleners in hun zorg na de operatie, zoals revalidatietherapie. Bij patiënten die al eerder depressief of angstig zijn geweest, is de hersteltijd van een postoperatieve depressie veel langer. Een studie suggereerde ook dat een operatie de ernst van de reeds bestaande depressie zou kunnen verergeren. Tot nu toe is er weinig bekend over waarom er zo’n sterk verband is tussen chirurgie en depressie. Sommige onderzoekers denken dat de psychologische reden op zich is dat veel mensen een postoperatieve depressie krijgen omdat de operatieve ingrepen hen dwingen hun eigen sterfelijkheid onder ogen te zien. Sommige studies legden ook de nadruk op de specifieke soorten chirurgie als zodanig op de inductie van postoperatieve depressie, aangezien depressie vaker lijkt te worden waargenomen bij sommige grote operaties, waaronder hersenchirurgie, heupvervangende chirurgie en kankerresectie. Recente studies suggereren echter dat de duur van de anesthesie verband houdt met de waarschijnlijkheid en de ernst van een depressie. Propofol is een van de meest gebruikte anesthetica in de intensive care setting na een operatie . Propofol behandeling bleek significant geassocieerd te zijn met cognitieve stoornissen in de postoperatieve periode . Tot nu toe is niet onderzocht of en hoe propofol de gemoedstoestand bij patiënten en dieren kan beïnvloeden. Daarom gebruikten we een muismodel met een enkele dosis propofol en testten de depressieve-achtige gedragingen in het muismodel. We ontdekten dat muizen blootgesteld aan een enkele dosis propofol angst-achtig gedrag vertoonden in een open veld test door minder tijd in het middengebied door te brengen en depressief-achtig gedrag in staart suspensie en geforceerde zwemtests door langere immobiliteitstijd dan controle muizen zonder injectie van propofol. Onze resultaten gaven aan dat propofol verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de stemmingswisselingen na de operatie en dat dit effect in verband kan worden gebracht met de invloed van propofol op de microgliacellen in het centrale zenuwstelsel (CZS).
2. Materialen en Methoden
2.1.
2.1. Dieren en behandeling met geneesmiddelen
In deze studie gebruikten we 8-10 weken oude mannelijke C57BL/6 muizen. Alle muizen hadden vrije toegang tot water en voedsel. Voor alle dierstudies hier, werden de muizen strikt behandeld volgens de richtlijnen opgesteld door de Chinese Raad voor Dierenzorg. Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van Qingdao Municipal Hospital, Shandong, China. Er waren twee groepen muizen in de studie: normale zoutoplossing (controles; ) en propofol (75 mg / kg; ). Een eenmalige injectie van propofol werd intraperitoneaal toegediend aan de muizen. Hiervoor werd commerciële propofol-injectievloeistof (Xi’an Libang Pharmaceuticals, China) gebruikt. De hier gebruikte dosis propofol is aangepast aan de vorige studie. Tijdens de anesthesie werden alle muizen op een verwarmingskussen gelegd om hun lichaamstemperatuur te behouden. Gedragstesten werden 1 week later uitgevoerd.
2.2. Open veld
Een vierkante houten doos werd hier gebruikt voor de open veld test zoals eerder beschreven . Aan het begin van de test werd elke muis in een hoek van het hokje geplaatst met het gezicht naar de muur. De totale afgelegde afstand en de totale tijd doorgebracht in de binnenste vierkanten van alle muizen werden geregistreerd en gemeten in een sessie van 5 minuten.
2.3.
2.3. Staartophangingstest
Voor de staartophangingstest werden de procedures uitgevoerd zoals eerder gerapporteerd. De muizen werden met de staart opgehangen met een bandje aan een kleine metalen haak, en in deze positie kunnen ze niet ontsnappen of zich vasthouden aan nabijgelegen oppervlakken. De totale tijd die de muizen doorgebracht immobiel tijdens de 6 min testperiode werd geregistreerd. Immobiliteit wordt gedefinieerd als een gebrek aan pogingen van de muizen om hun lichaam te bewegen.
2.4.
We voerden de geforceerde zwemtest uit zoals eerder gerapporteerd. Muizen werden in een glazen bekerglas gevuld met water bij kamertemperatuur geplaatst. We testten de totale immobiele tijd van muizen in een 15 min testsessie, en de laatste 6 min werd gescoord voor immobiliteitsduur. Aan het einde van elke test werden de natte muizen onmiddellijk in een kooi met normale bodembedekking geplaatst nadat ze waren opgewarmd in een droge handdoek.
2.5.
2.5. Elevated Plus Maze Test
Het verhoogde plus doolhof is een eenvoudige methode om de angstrespons van dieren te evalueren. We testten het angstniveau van muizen met behulp van de verhoogde plus doolhof test zoals eerder gerapporteerd. In principe is het verhoogde plus doolhof apparaat uitgerust met twee open en twee gesloten armen en opgeheven tot een hoogte van ongeveer 50 cm boven de grond. Aan het begin van elke test werd de muis in het centrale vierkant geplaatst met het gezicht naar de open arm en mocht vervolgens de armen gedurende 5 minuten verkennen. De hoeveelheid tijd die in de open armen werd doorgebracht, werd geregistreerd en geanalyseerd door een persoon die niet bij de experimentele opzet was betrokken.
2.6. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
We maten het IL-6 niveau in hersenweefsel met behulp van een commerciële ELISA kit (eBioscience, Thermo Fisher Scientific). Elk monster werd in duplo getest met de juiste verdunningen, zodat de relatieve luminescentie-eenheden binnen het lineaire bereik van de standaardcurven konden vallen. De waarde van IL-6 van elk monster werd genormaliseerd en uitgedrukt als een relatieve verhouding ten opzichte van het totale beladingseiwit. De absorptie van elk monster werd gemeten met een microplatelezer (Synergy Mx, BioTek, Winooski, VT).
2.7. Western Blot
Opgeloste hersenmonsters werden verwerkt en op SDS-PAGE gels uitgevoerd. Ze werden vervolgens overgebracht op PVDF-membranen die vervolgens werden geblokkeerd met 5% magere melk in TBST-buffer. De geblokkeerde membranen werden verder onderzocht met antilichamen tegen CD11b (1 : 4000; Abcam, UK), synaptophysine (SYP), p-Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA), en totaal Stat-3 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA) in TBST-melk gedurende de nacht bij 4°C. Na incubatie met de secundaire antilichamen gedurende respectievelijk 2 uur bij kamertemperatuur werden de eiwitbanden op de membraan onthuld met chemiluminescentiereactie. β-Actine werd gebruikt als interne controle (1 : 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Kwantitatieve resultaten werden uitgedrukt als een verhouding van elk doeleiwit tot zijn β-actine.
2.8. Statistische analyse
Waarden gepresenteerd in de studie werden weergegeven als de . De significantie van verschil tussen twee groepen werd bepaald door Student’s -test analyse. Een waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
3. Resultaten
3.1. Eenmalige blootstelling aan een dosis propofol veroorzaakte depressief gedrag bij muizen door middel van staartophanging en geforceerd zwemmen
Eerst testten we de hypothese of een eenmalige dosis propofol langdurige effecten kon hebben op het gedrag van muizen door ons te richten op de depressieve manier. We gebruikten de staart suspensie en gedwongen zwemmen testen in deze muizen om de lange termijn effecten van propofol te onderzoeken. In de staart suspensie test, vonden we propofol aanzienlijk verhoogd de immobiele tijd in vergelijking met de controle muizen zonder propofol behandeling wanneer de muizen werden opgehangen in de staart (figuur 1). Om de depressieve-achtige gedragingen in de muizen blootgesteld aan propofol verder te bevestigen, gebruikten we de kracht zwemmen methode om de immobiele tijd van deze muizen te meten. Onze resultaten toonden aan dat propofol de totale tijd van onbeweeglijkheid verhoogde in vergelijking met muizen in de controlegroep (figuur 2). Deze bovenstaande bevindingen toonden aan dat een enkele dosis propofol-behandeling de depressieve gedragsprestaties bij muizen op lange termijn kon veroorzaken en in stand houden.
3.2. Single Dose of Propofol Exposure Caused Anxiety-Like Behaviours in Mice with Open Field and Elevated Plus Maze Tests
Anxiety is the highest cooccurrence complication in depression. Daarom stelden wij de vraag of propofol angst-achtige gedragingen kon induceren bij deze muizen, op basis van de bovengenoemde gedragsresultaten bij deze muizen. We gebruikten het open veld assay om het angstniveau van deze muizen te testen. Zoals blijkt uit figuur 3 (a), propofol behandeling effectief verminderde de totale tijd muizen besteed aan het centrum gebied in het open veld. En we hebben ook gemeten een andere belangrijke parameter van de test, de totale reisafstand van de muizen. Zoals we verwachtten, propofol injectie aanzienlijk verminderd de reisafstand van muizen in de 5 min testsessie in vergelijking met controle muizen (figuur 3 (b)). Vervolgens onderzochten we de angst-achtige gedragingen van deze muizen in verhoogde plus doolhof assay. We vonden dat muizen blootgesteld aan propofol aanzienlijk minder tijd doorgebracht in open armen (figuur 4), die in overeenstemming was met de resultaten van het open veld test toonden.
(a)(a)
(b)(b)
(b)
(b)
(a)
(b)
3.3.
3.3. Eenmalige blootstelling aan een dosis propofol veroorzaakte een verhoogd niveau van IL-6 in het hersenweefsel van muizen
Een recente studie suggereerde de betrokkenheid van neuroinflammatie bij postoperatieve delirium-achtige cognitieve stoornissen. Wij testten of propofol het expressieniveau van IL-6 in de hersenweefsels van deze muizen kon beïnvloeden. Om tot deze conclusie te komen, voerden we ELISA assay uit in de hersenweefsels (hippocampus en cortex) om het niveau van IL-6 te beoordelen in muizen met of zonder behandeling met propofol. Onze resultaten toonden aan dat een behandeling met propofol in deze toestand het expressieniveau van dit cytokine in de hersenen van muizen die aan propofol waren blootgesteld, kon opdrijven (figuur 5). Dit resultaat wees erop dat propofol de angst- en depressieve gedragingen bij muizen zou kunnen veroorzaken door de ontstekingsreactie in hun hersenen te beïnvloeden.
3.4.
Ten slotte onderzochten we de mogelijke cellulaire en moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de gedragsveranderingen bij muizen die aan propofol waren blootgesteld. We testten of gliale cellen werden beïnvloed door de propofol behandeling door te kijken naar het microgliale maker eiwit, CD11b. Met een western blot studie, vonden we het expressieniveau van CD11b was verminderd in de hersenen van muizen met propofol behandeling (figuur 6 (a)), die suggereerde dat microgliale functie zou kunnen worden gereguleerd door de propofol behandeling. Ondertussen werd de expressie van het presynaptische eiwit SYP niet beïnvloed door de propofol behandeling (figuur 6 (c)). We onderzochten ook de functie van de transcriptionele factor STAT-3 door het onderzoeken van de fosforylering status van STAT-3 (p-STAT-3). Onze western blot resultaten toonden aan dat propofol behandeling het verhoogde expressieniveau van p-STAT-3 veroorzaakte zonder de expressie van totaal STAT-3 te beïnvloeden (figuur 6(b)). Deze bevindingen impliceerden dat propofol de microgliale celfunctie zou kunnen beïnvloeden en de fosforylering van STAT-3 zou kunnen verhogen terwijl het angst- en depressieve gedrag bij muizen wordt geïnduceerd.
(a)(a)
(b)(b)
(c)(c)
(a)
(b)
(c)
4. Discussie
Cognitieve en geheugenstoornissen zijn redelijk bestudeerd, maar de postoperatieve stemmingsfluctuatie heeft tot nu toe niet genoeg aandacht getrokken. Sommige bewijzen ondersteunden het idee dat er significante stemmingsveranderingen optraden bij de patiënten die blootgesteld werden aan chirurgie en anesthesie. Hier hebben we een nieuwe hypothese getest, namelijk dat de anesthesiebehandeling op zich voldoende kan zijn om de gemoedstoestand significant te beïnvloeden bij dieren die een eenmalige dosis anesthesiebehandeling ondergingen zonder een begeleidende chirurgische ingreep. We gebruikten propofol als de representatieve anesthesieverbinding en injecteerden dit intraperitoneaal bij de muizen. In de daaropvolgende dagen werd een reeks depressieve en angstige gedragingen uitgevoerd om de stemmingsveranderingen bij de muizen te observeren. Er bleken significante verschillen te bestaan tussen de gedragingen van de muizen met en zonder blootstelling aan propofol. Omdat deze propofol-geïnduceerde effecten nog geruime tijd aanhielden, zelfs nadat de medicatie was afgebouwd, stelden wij dat deze effecten niet de acute invloed van de narcose waren, maar werden gemedieerd door andere systemen in het CZS.
Neuro-inflammatie blijkt een van de belangrijkste factoren te zijn die bijdragen aan depressie en andere stemmingsveranderingen in het CZS. Hier vroegen we of een microgliale cel geactiveerd was in de hersenen van muizen na blootstelling aan propofol. De microgliale cel proteïnemerker, CD11b dat een van de gebruikelijke merker-eiwitten is om de activatie van microglia aan te tonen, werd onderzocht met behulp van Western blot. Verrassend genoeg bleek uit onze resultaten dat propofol het eiwitniveau van CD11b kon remmen. De plausibele verklaring hiervoor is dat propofol de CD11b eiwitexpressie kon remmen, ongeacht of de microgliacellen geactiveerd waren of niet. De prominente vooruitgang van propofol kan belangrijk zijn voor de potentiële behandeling van het verlichten van de microgliale overactivatie bij sommige pathologische condities van het CZS, zoals trauma, beroerte, en multiple sclerose. We onderzochten ook het effect van propofol op de synaptische proteïnen die zeer belangrijke fundamentele factoren zijn achter de gedragsprestaties van dieren. Interessant is dat, hoewel propofol de microgliale celfunctie kan beïnvloeden, het geen effect lijkt te hebben op het expressieniveau van synaptische eiwitten. Deze bevindingen zijn niet in overeenstemming met een aantal eerdere rapporten. De mogelijke reden kan te wijten zijn aan het verschil in tijdvenster wanneer de eiwitten werden verzameld nadat de propofol was toegediend. Maar onze bevindingen suggereren nog steeds dat propofol een verschillend effect kan hebben op neuronen en andere gliale cellen. In de toekomstige studie, moeten de effecten van propofol op gliale en neuronale cellen afzonderlijk worden uitgewerkt.
De neuro-inflammatoire respons in het CZS blootgesteld aan de enkele dosis propofol werd verder gevalideerd door de ELISA test van IL-6 in deze twee groepen muizen. Wij vonden dat propofol behandeling een upregulatie van IL-6 in de muizen hersenen kon induceren. Deze bevindingen waren in overeenstemming met de resultaten van propofol op de microgliale celfunctie. Terwijl het de CD11b component remt, kan propofol de relevante signaalwegen activeren die belangrijk zijn voor de microgliale cel activatie.
Collectief, suggereerde onze studie dat propofol in staat was om de microgliale celfunctie te beïnvloeden en de ontstekingsreactie in het CZS te verergeren. De cellulaire en moleculaire reactie zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de gedragsveranderingen bij deze muizen die zijn toegediend met de enkele dosis propofol. Onze studie benadrukte de belangrijke rol van anesthetica op de invloed van stemmingsveranderingen na de operatie, maar de stemming zou aanzienlijk beïnvloed kunnen worden door vele factoren, waaronder ontsteking die vrij vaak gezien wordt bij de patiënten tijdens en na de operatie. Daarom is een reeks goed opgezette, systemische studies op een diermodel, waarbij niet alleen de anesthetica maar ook de operatieprocedure betrokken zijn, voor de toekomst gerechtvaardigd.
Beschikbaarheid van gegevens
De gegevens die gebruikt zijn om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.
Belangenconflicten
Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Erkenningen
De auteurs danken de financiële steun van de afdeling Orthopedie, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao, Shandong, China, en de technische steun van Weifang Medical University, Weifang, China.