Alle banen: beta Actin antilichaam – ladingscontrole (ab8227) bij 1/5000 verdunning
Baan 1: HeLa gehele celextract
Baan 2: Gistcellenextract
Baan 3: Muis hersenweefsel lysaat
- Bekijk onze lijst met beschikbare positieve controle lysaten, blokkerende peptiden, en positieve controle eiwitten.
- Bekijk AbExcel secundaire antilichamen voor uitzonderlijke western blots.
- Bekijk onze eenvoudig te volgen videoprotocollen.
Protocollen worden door Abcam “AS-IS” verstrekt op basis van experimenten in Abcam’s laboratoria met gebruik van Abcam’s reagentia en producten; uw resultaten van het gebruik van protocollen buiten deze voorwaarden kunnen variëren.
Webinartranscript
Het doel van western blotting is om eiwitten op een gel te scheiden op basis van het moleculaire gewicht. De eiwitten worden vervolgens overgebracht op een membraan waar ze kunnen worden gedetecteerd met antilichamen. Verwarm de monsters en 95 graden C gedurende vijf tot 10 minuten in een monsterbuffer die een reductiemiddel zoals beta-mercaptoethanol bevat. Dit resulteert in gelineariseerde eiwitten met een negatieve lading die evenredig is met hun grootte.
Plaats een gel in de elektroforesetank en voeg buffer toe, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat de bovenkanten van de putjes bedekt zijn. Het acrylamide percentage van de gebruikte gel is afhankelijk van het molecuulgewicht van het doeleiwit. Nodeer een molecuulgewichtmarkt in de eerste lane en laad vervolgens de monsters in de aangrenzende wells. Alle monsters die gelijke hoeveelheden eiwit bevatten. Zodra alle monsters geladen zijn, ad running buffer, plaats het deksel op de elektroforesetank. Zet de voeding aan en stel de spanning in die door de fabrikant van de gels in de geltank wordt aanbevolen. U moet in staat zijn belletjes door de tank te zien opstijgen. Laat de gel lopen totdat het dieefront zich voldoende over de gel heeft verplaatst.
De volgende stap is het overbrengen van de eiwitten uit de gel op een membraan. Membranen zijn meestal gemaakt van nitrocellulose of PVDF. Haal de gel uit de tank en haal hem voorzichtig uit de plastic houder. Snijd de wells en de gelvoet open en plaats de gel in transferbuffer. Bereid de transferstapel voor door het membraan en de gel tussen filtreerpapier en sponzen te sandwichen. Het membraan moet op de positieve elektrode worden gelegd en de gel het dichtst bij de negatieve elektrode. Gebruik een kleine roller om eventuele luchtbellen tussen de gel en het membraan te verwijderen. Dop de transferkamer dicht en dompel hem onder in een transfertank met transferbuffer. Voeg water toe aan de buitenste kamer om het systeem koel te houden en doe het deksel erop. Zet de voeding aan om de eiwitoverdracht te beginnen. Tijd en spanning vereisen optimalisatie, dus controleer de instructies van de fabrikant voor guidance.
Nu dat de eiwitten zijn gemigreerd van de gel op de nitro cellulose membraan, kan het eiwit van belang worden gedetecteerd als een antilichaam. Het membraan kan worden verwijderd uit de cassette en het molecuulgewicht markt moet nu zichtbaar zijn. Indien nodig kan de overdracht van eiwitten worden bevestigd door het membraan met oplossing te kleuren. Om aspecifieke binding van het antilichaam te voorkomen, moet het membraan worden geblokkeerd. Giet blokkeerbuffer op het membraan en roer het zachtjes op een wip. Gewoonlijk gebeurt dit met een oplossing van vijf procent melk of boviene serumalbumine, BSA, gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 graden. De tijd en het type blokkeerbuffer moeten worden geoptimaliseerd, dus controleer het gegevensblad van het primaire antilichaam dat u van plan bent te gebruiken voor details.
Nadat het membraan is geblokkeerd, verwijdert u de blokkeerbuffer en voegt u het verdunde primaire antilichaam in dezelfde oplossing toe. Incubeer op de rocker zoals voorheen. De incubatie van het primaire antilichaam duurt gewoonlijk een uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden C. De antilichaamconcentratie en de incubatietijd moeten worden geoptimaliseerd. Raadpleeg het gegevensblad van het antilichaam voor aanwijzingen. Giet het primaire antilichaam af en spoel het membraan tweemaal in wasbuffer. Vervolg met een wasbeurt van 15 minuten en drie wasbeurten van 10 minuten op een wip. De wasbuffer is gewoonlijk trys gebufferde zoutoplossing, TBS, of fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS, met 0,1 procent tween 20.
Afgieten van de wasbuffer en incuberen van het membraan in conjugerend secundair antilichaam dat is verdund in blockingbuffer. Gewoonlijk gebeurt dit gedurende een uur bij kamertemperatuur, maar de antilichaamconcentratie en de incubatietijd moeten worden geoptimaliseerd. Trek het secundaire antilichaam eraf en was het membraan zoals eerder is aangegeven.
Er zijn verschillende systemen voor detectie. Als de secundaire antilichamen conjugeren in een enzym, incubeer dan het membraan in het juiste substraat voor de beeldvorming. Als de secundaire antilichamen fluorescerende counjugaten zijn, kunt u direct overgaan tot de beeldvormingsstap. De beeldvorming kan worden uitgevoerd met röntgenfilm of met een digitaal beeldvormingssysteem. Plaats het membraan in een imaging tray. Plaats de imaging tray in het imaging systeem. De belichtingstijd zal waarschijnlijk moeten worden geoptimaliseerd om de banden met betrekking tot de eiwitten van belang duidelijk te detecteren.