Heading

Een confocale microscoop is een type 3D fluorescentiemicroscoop waarbij de resolutie wordt verhoogd door out-of-focus licht te weren. Dit wordt gedaan door het gebruik van pinholes met een specifieke Pinhole Radius en maakt het tot een intrinsieke 3D microscoop: door de focusserende aard van de confocale microscoop, is deze speciaal geschikt voor het verkrijgen van 3D beelden als een verzameling intensiteiten op verschillende punten van de ruimte.
Confocale beelden zijn zeer geschikt voor Huygens deconvolutie, met de Huygens Confocal Optical Option, vanwege twee belangrijke redenen:
1. ze hebben nog steeds last van onscherpte, wat duidelijk te zien is bij het opnemen van kraalbeelden
2. in het algemeen zijn confocale beelden ruisachtiger dan widefield beelden, omdat licht van het object wordt afgewezen door het pinhole.
In confocale microscopen is de Nyquist Rate ongeveer de helft van die in Widefield Microscopen.

Hoe een confocale microscoop werkt

Biologische systemen zijn typisch driedimensionale structuren. Wanneer het met een fluorofoor gelabelde monster wordt overspoeld met excitatielaserlicht, zoals bij conventionele breedveldmicroscopie, wordt het resulterende beeld gewoonlijk sterk verstoord door onscherp fluorescerend licht. Dit leidt tot een vervaging van het beeld en tot een aanzienlijke vermindering van het contrast. Confocale microscopie is een techniek om dit ongewenste onscherpe licht te verminderen. Bij deze techniek wordt het excitatielicht strak in het monster gefocust. Het emissielicht uit het brandpunt wordt opgevangen door hetzelfde objectief, waarna het door een klein gaatje wordt gefocusseerd en naar een fotodetector wordt geleid (figuur 1 (a)). Het onscherpe emissielicht wordt grotendeels door het gaatje geblokkeerd (figuur 1 b)). Het resultaat van deze methode is dat alleen het licht uit het brandpuntsvolume de detector kan bereiken. Het nadeel is dat ook licht van andere plaatsen in het brandvlak wordt geblokkeerd: confocale microscopie is puntgewijze excitatie en puntgewijze detectie. Een oplossing bestaat erin het preparaat punt voor punt in een raster te scannen om een volledig beeld te reconstrueren waarin alleen het fluorescentiesignaal van het brandvlak wordt verzameld. Dit rasterscannen kan worden herhaald voor verschillende brandpuntsvlakken om dikke monsters te doorsnijden en een 3D-beeld van het monster te reconstrueren.
Alternatief is het ook mogelijk om het monster met meerdere excitatievlekken parallel te scannen, zoals met een Spinning Disk microscoop.

STED is praktisch een uitbreiding van punt-scannende confocale microscopie. De STED-bundel moet in het monster worden gericht om de hoge intensiteit te verkrijgen die nodig is voor de gestimuleerde emissie, terwijl de puntsgewijze detectie het out-of-focus licht vermindert. Om STED te laten werken, moeten het centrum van de excitatiefocus en het nulpunt van de STED-intensiteit van de donutvormige focus perfect overlappen. Een beeld kan dan worden verkregen door het monster rastergewijs te scannen, bijvoorbeeld met een piëzoscantrap. De grootte van het gebruikte pinhole bepaalt de scherptediepte van de microscoop.

Figuur 1. Illustratie van het principe van de confocale microscoop. Een gecollimeerde bundel excitatielicht (blauw) wordt door een microscoopobjectief strak in het monster gefocust. De linker afbeelding laat zien dat het emissielicht van de brandpunt door het gaatje wordt gefocusseerd en dat het meeste licht de detector bereikt. De rechter afbeelding toont het geval waarin het uitgezonden licht afkomstig is van een punt dat zich buiten het brandpuntvolume bevindt. Dit licht zal niet door het pinhole worden gefocusseerd en slechts een zeer kleine hoeveelheid licht zal de detector kunnen bereiken. Het resultaat is dat het onscherpe fluorescerende licht grotendeels door het pinhole wordt tegengehouden en dat het achtergrondsignaal daardoor aanzienlijk wordt gereduceerd.

Deconvolutie van confocale beelden

Toepassing van deconvolutie op confocale beelden verhoogt hun resolutie in x, y en z en herstelt ze van ruis. Daarom zullen de beelden gemakkelijker te visualiseren en te analyseren zijn. Het standaard algoritme voor confocale beelden is Classic Maximum Likelihood Estimation (CMLE) en de standaard SNR waarde is 20. Wij stellen voor om met de standaardparameters te beginnen en andere SNR-waarden te onderzoeken, bijvoorbeeld om de deconvolutieresultaten te optimaliseren. Je moet de SNR niet zien als een parameter die het originele beeld beschrijft, maar als een instelbare parameter die het gedeconvolueerde resultaat controleert. Het gebruik van een te grote SNR waarde kan riskant zijn bij het restaureren van ruisige originelen, omdat je de ruis alleen maar zou kunnen versterken. Een confocaal beeld met ruis kan SNR-waarden lager dan 20 hebben. Een andere optie is het testen van het GMLE-algoritme (Maximum Likelihood Estimation) om de resultaten te verbeteren. De GMLE is geschikt voor ruisige beelden, zoals confocale of STED.

Probeer Huygens gratis op uw confocale beelden

U bent van harte welkom om Huygens te downloaden via onze Download pagina en een testlicentie aan te vragen met volledige opties.
Remko R.M. Dijkstra, Ontwerp en realisatie van een CW-STED superresolutiemicroscoop opstelling, Master Thesis , Universiteit Twente, 2012