Métodos de enxertia de Arabidopsis thaliana e Eutrema salsugineum

O artesanato, uma técnica agronómica antiga, é um tipo de propagação vegetativa/asexual de plantas. É geralmente realizada através da exploração do crescimento do calo após a lesão da planta. A enxertia é ainda uma técnica comum no campo da jardinagem. A enxertia tem sido utilizada na agricultura desde > 2 000 anos a.C. (Antes da Era Comum) na China. É amplamente utilizada na agricultura, e no cultivo de árvores florestais, e plantas hortícolas. Por exemplo, cultivares com resistência aos agentes patogénicos ou tolerância ao stress são normalmente utilizadas como porta-enxertos para melhorar o vigor de crescimento de cultivares acima do solo com elevados valores económicos. A enxertia também tem sido utilizada para quebrar a fase juvenil, a fim de promover a floração em espécies lenhosas. Em comparação com as culturas geneticamente modificadas, as plantas enxertadas são mais palatáveis para o público. A enxertia é também uma técnica útil na investigação científica vegetal. Esforços consideráveis nesta direcção começaram nos anos 70 e 80 do século passado. No entanto, com o rápido desenvolvimento da biotecnologia, o foco da investigação sobre enxertia passou gradualmente da melhoria das características agronómicas para o estudo do mecanismo molecular. Estudos demonstraram que a enxertia é uma excelente ferramenta na elucidação de mecanismos envolvidos em processos de sinalização de longo alcance dentro das plantas, tais como os envolvidos na floração, regulação de auxinas, tolerância a metais pesados, pequeno movimento de ARN, estado nutricional, e silenciamento nuclear .

É bem conhecido que os factores que afectam as taxas de sobrevivência dos enxertos dependem principalmente da compatibilidade do porta-enxerto e do enxerto. A compatibilidade refere-se à semelhança entre o porta-enxerto e o enxerto no que diz respeito às características estruturais, genéticas e fisiológicas, e à capacidade de se adaptarem uns aos outros após a enxertia. A compatibilidade dos enxertos das mesmas plantas é a mais forte; quanto mais distante for a relação entre as plantas, mais fraca é a compatibilidade entre elas. É difícil enxertar plantas de diferentes géneros. Para além da compatibilidade de cepas e porta-enxertos, o vigor do porta-enxerto e do enxerto é também um factor importante que afecta a sobrevivência dos enxertos. A taxa de sobrevivência das plantas enxertadas também varia com as espécies, e a taxa de sobrevivência do corpo enxertado é diferente mesmo na mesma espécie, em idades diferentes. Além disso, factores ambientais como a temperatura, humidade e intensidade luminosa podem também afectar a taxa de sobrevivência das plantas enxertadas. Em conclusão, há muitos factores que influenciam a taxa de sobrevivência dos enxertos.

Arabidopsis thaliana e Eutrema salsugineum (Thellungiella salsuginea) pertencem à mesma família Cruciferae, mas géneros diferentes. A Arabidopsis thaliana é utilizada como planta modelo em estudos genéticos de plantas dicotiledóneas. Eutrema Salsugineum (também conhecida como Salt cress) é uma planta excelente tolerante ao sal, e o genoma de E. salsugineum foi completado. Aproximadamente 95% dos genes do E. salsugineum são semelhantes aos expressos em Arabidopsis , e a maioria das sequências de aminoácidos são as mesmas que as do Arabidopsis . O Eutrema salsugineum tem um genoma nuclear relativamente pequeno, aproximadamente duas vezes superior ao de A. thaliana . Todos os ecotipos do E. salsugineum mostram resistência a uma série de tensões ambientais tais como o frio, a seca e as tensões oxidativas . O E. salsugineum tem ganho atenção devido à sua extrema tolerância ao sal. Por conseguinte, o salgadinho foi sugerido como um halófito modelo para o estudo da tolerância ao sal há mais de 20 anos . Isto abriu uma nova janela para a investigação abrangendo uma vasta gama de aspectos, incluindo não só o stress abiótico, mas também a fotossíntese, a função das proteínas relacionadas com o stress, e a produção de cera de superfície utilizando E. salsugineum como planta modelo. Em Arabidopsis, foram desenvolvidas várias abordagens de enxertia para investigar a sinalização sistémica . No entanto, tanto quanto sabemos, não existe qualquer relatório sobre métodos de enxertia de E. salsugineum, ou sobre métodos de enxertia entre Arabidopsis e Eutrema. A dificuldade de enxertia entre estas plantas é significativamente elevada. A enxertia bem sucedida destas duas plantas-modelo ajudará a fornecer conhecimentos cruciais sobre os mecanismos moleculares subjacentes à tolerância ao stress das plantas. Aqui demonstramos dois métodos estéreis de micro-enxertia entre Arabidopsis e Eutrema, com as vantagens da simplicidade e alta taxa de sobrevivência.

Métodos de micro-enxertia

Neste estudo, concentramo-nos em dois protocolos eficientes de micro-enxertia estéril de plântulas entre Arabidopsis, uma planta sensível ao sal, e uma planta tolerante ao sal. Um método foi o corte hipocótil-hipocótilo de superfície plana das plântulas, como descrito por Seung e Turnbull et al. com algumas modificações. O outro método foi a enxertia cortada, que demonstraremos aqui. A abreviatura A/E aqui utilizada indica que A. thaliana scions foram enxertadas em populações de E. salsugineum, e inversamente E/A indica que E. salsugineum scions foram enxertadas em populações de A. thaliana. Numa experiência de controlo, foi realizada a auto-grafagem de A. thaliana e E. salsugineum. As plântulas auto-grafadas de A. thaliana são referidas como A/A e as plântulas auto-grafadas de E. salsugineum são referidas como E/E. Foram aplicados métodos optimizados de enxertia a diferentes porta-enxertos e cepas. O método de enxertia por corte foi utilizado para A/E (Fig. 1a) e o outro método, ou seja, o corte hipocótil-hipocótilo de superfície plana foi utilizado para A/A, E/E, e E/A (Fig. 1c, d). É relativamente fácil conseguir um enxerto bem sucedido usando o método convencional de enxertia (isto é, corte plano de superfície hipocótil-hipocótilo), e o subsequente crescimento de plantas enxertadas é geralmente satisfatório. Por conseguinte, não discutiremos este método aqui.

Materiais e condições de crescimento

Sementes de A. salsugineum (Shandong, China) usadas neste estudo são preservadas e propagadas no nosso laboratório. As plantas foram cultivadas em condições de luz diurna longa (LD 16/8 h luz/escuro) ou curta (SD 8/16 h luz/escuro), com ciclos dia/noite a 22 °C/18 °C e 100 μmol m-2s-1 intensidade de luz.

Procedimento de enxertia

O protocolo passo-a-passo do método de enxertia por corte aplicado para A/E foi o seguinte:

p>Preparação de porta-enxertos e materiais de enxerto: as sementes de agriões de sal foram desinfectadas com 0.5% NaClO (cloridrato de sódio) durante 6 min seguidos de 4-5 enxaguamentos em água destilada, e subsequentemente semeados em condições estéreis com meio Murashige e Skoog (MS) com 1,0% de ágar e 1% de açúcar. Uma semana após o tratamento de estratificação a baixa temperatura (4 °C), as plântulas foram transferidas para condições SD e cultivadas verticalmente com luz durante 10-15 dias (ou 7-10 dias após a germinação) como plântulas de porta-enxertos. Para a germinação das sementes de Arabidopsis, o método de esterilização e as condições de crescimento foram as mesmas que as do E. salsugineum, excepto o tratamento de estratificação a baixa temperatura (4 °C), que foi durante 2-3 dias. A idade ideal para a enxertia das plântulas de Arabidopsis é de 3-5 dias. Dado que o tempo de germinação e a taxa de crescimento das duas espécies são diferentes, os tempos de plantio foram ajustados em conformidade. Normalmente a Arabidopsis deve ser plantada após a germinação das sementes de agrião salgado.

p>p>Grafting em condições estéreis (Fig. 1a): O procedimento de enxertia foi realizado sob microscópios anatómicos numa campânula estéril. E. Salsugineum seedlings de tamanho uniforme foram movidas usando pinças para novo meio de ágar MS de 1,0% de resistência média. Para serem utilizadas como porta-enxertos, as verdadeiras folhas e meristemas foram removidos das plântulas de agrião de sal com uma lâmina de lâmina de aço inoxidável de dois gumes, enquanto que os cotilédones foram retidos. Nas mesmas condições estéreis, o hipocótilo de A. thaliana foi cortado transversalmente a aproximadamente um quarto da altura do topo (tipicamente 2-3 mm) e a parte superior da plântula foi utilizada como enxerto. O corte de A. thaliana como cepas pode ser efectuado directamente nos pratos médios originais ou nos pratos onde o agrião de sal foi preparado como porta-enxertos. O enxerto de A. thaliana foi enxertado em agrião de sal sem qualquer dispositivo de fixação, porque a pequena quantidade de líquido nas superfícies de corte das duas partes é suficiente para as manter juntas. Posteriormente, a placa de Petri foi rápida mas cuidadosamente selada com parafilme para preservar a humidade. Por favor, tenha cuidado para se certificar de que as folhas são naturalmente estendidas para evitar possíveis desalojamentos devido ao crescimento das plantas.
p>c>Cultura do corpo enxertado: O complexo A/E enxertado foi colocado em condições SD num armário de crescimento Percival durante 6-8 dias.
Transplante de plântulas enxertadas (Fig. 2): Seis a oito dias após a enxertia, a interface da junta de topo foi examinada sob um microscópio anatómico. O enxerto bem sucedido deve ter uma ligação sólida entre o enxerto e a planta. As plântulas foram então transferidas para um sistema hidropónico ou solo nutritivo por exigência. Após o transplante, deve prestar-se atenção para cortar as raízes adventícias a tempo, se as raízes adventícias ocorrerem.

Figcaption>Fig. 2

p>p>Succeed grafted seedlings. a Self-grafting of A. thaliana (A/A). b A/E grafted seedlings. c Self-grafting of E. salsugineum (E/E). d E/A grafted seedlings. Setas vermelhas em a-c denotam locais de enxertia. As raízes de Arabidopsis thaliana como porta-enxertos são mostradas por setas de diferentes cores em d, setas azuis indicam as raízes após a enxertia, e as setas amarelas indicam as raízes antes da enxertia

desinfecção da superfície das sementes

No método de enxertia por corte, a superfície das sementes foi desinfectada directamente usando 0.5% de cloridrato de sódio (NaClO) durante 6-8 min, e depois lavado com água esterilizada durante 4-6 vezes. Este método evita o uso de álcool para esterilização. Além disso, o método de esterilização com NaClO é simples, reduzindo assim a poluição secundária, e as sementes podem germinar normalmente. Também evita a não germinação das sementes devido a uma esterilização excessiva, que afecta a germinação das sementes e as análises subsequentes. Desde que a concentração de NaClO seja devidamente controlada, a esterilização excessiva não ocorrerá mesmo que a esterilização dure vários minutos.

Idade das sementes

No método de enxertia por corte, E ligeiramente mais antigo. salsugineum (7-10 dias após a germinação) com raízes laterais, pode satisfazer melhor as características de crescimento rápido das suas plântulas (A. thaliana), isto também reduz a formação de raízes adventícias, melhora muito a taxa de sobrevivência dos enxertos e assegura o crescimento vigoroso das plântulas enxertadas numa fase posterior (Quadro 1). Verificámos que as plântulas de 3-5 dias de idade da Arabidopsis eram favoráveis para melhorar a taxa de sobrevivência das plântulas enxertadas; também apoia o crescimento vigoroso das plântulas enxertadas (Quadro 1). Isto pode ser porque o ciclo de vida de A. thaliana é curto, comparado com o de E. salsugineum. Portanto, a utilização de plântulas de A. thaliana mais velhas como cepas resultou em baixas taxas de sobrevivência; mesmo que os enxertos A/E tenham sobrevivido, o crescimento em fases posteriores foi fraco e a floração precoce é geralmente observada.

Table 1 Variando a idade das plântulas em enxertia A/E

Método de corte de superfície plana

Métodos múltiplos de enxertia foram relatados para A. thaliana . No presente estudo, o método de enxerto de superfície plana foi utilizado apenas para enxertos A/E e o método de corte de superfície plana hipocótil-hipocótilo foi utilizado para A/A, E/E, e E/A (Fig. 1c, d). Os dois métodos requerem as mesmas condições de culto, excepto para o local de corte. As plântulas com 3-5 dias de idade foram utilizadas para a auto-gestação de A/A. Para a enxertia de E/A, as plântulas de 7 a 10 dias de idade de A. thaliana como porta-enxertos são mais benéficas para a sobrevivência dos enxertos. Da mesma forma, as plântulas de 7-10 dias de idade foram utilizadas para a auto-genxertia de E/E. Verificámos que tanto a taxa de sobrevivência como o crescimento posterior das plântulas de A/E eram significativamente diferentes entre os dois métodos de enxertia (Fig. 1a, b e Quadro 2). O método de enxertia é mais satisfatório para a enxertia A/E. A principal razão pode ser a taxa de crescimento rápido de A. thaliana é melhor acomodada utilizando este método. Quando o tradicional corte de superfície plana foi utilizado para enxertia de A/E, as raízes adventícias do enxerto aparecem antes da formação do calo na junção, afectando a taxa de sucesso das plantas enxertadas, porque o crescimento do agrião salino é mais lento do que o de A. thaliana. Em comparação, a taxa de sucesso do método cut-in é quase 100% desde que o corte seja liso e duas partes bem colocadas.

Table 2 Effects of two grafting methods on A/E grafting

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