Heading

Enten, een oude agronomische techniek, is een vorm van vegetatieve/asexuele vermeerdering van planten. Het wordt gewoonlijk uitgevoerd door gebruik te maken van callusgroei na verwonding van de plant. Enten is nog steeds een veel gebruikte techniek in de tuinbouw. Enten wordt in de landbouw gebruikt sinds > 2 000 jaar voor Christus (Before the Common Era) in China. Het wordt op grote schaal gebruikt in de landbouw en bij de teelt van bosbomen en tuinbouwgewassen. Zo worden cultivars die resistent zijn tegen ziekteverwekkers of stress verdragen, gewoonlijk als onderstam gebruikt om de groeikracht van bovengrondse cultivars met een hoge economische waarde te verbeteren. Enten is ook gebruikt om het jeugdstadium te doorbreken en zo de bloei bij houtachtige soorten te bevorderen. In vergelijking met genetisch gemodificeerde gewassen zijn geënte planten smakelijker voor het publiek. Enten is ook een nuttige techniek in het plantenwetenschappelijk onderzoek. In de jaren 70 en 80 van de vorige eeuw zijn aanzienlijke inspanningen in deze richting gedaan. Met de snelle ontwikkeling van de biotechnologie is het zwaartepunt van het onderzoek naar enten geleidelijk verschoven van de verbetering van agronomische eigenschappen naar de studie van moleculaire mechanismen. Studies hebben aangetoond dat enten een uitstekend instrument is voor het ophelderen van mechanismen die betrokken zijn bij lange afstand signaal processen binnen planten, zoals die betrokken zijn bij de bloei, auxine regulatie, zware metalen tolerantie, kleine RNA beweging, voedingstoestand, en nucleaire silencing.

Het is bekend dat de factoren die van invloed zijn op de overlevingskansen van enten voornamelijk afhangen van de compatibiliteit van de onderstam en de ent. Compatibiliteit verwijst naar de gelijkenis tussen de onderstam en de ent met betrekking tot structurele, genetische en fysiologische kenmerken, en het vermogen om zich na het enten aan elkaar aan te passen. De compatibiliteit van enten van dezelfde planten is het sterkst; hoe verder de planten van elkaar verwijderd zijn, hoe zwakker de onderlinge compatibiliteit. Het is moeilijk om planten van verschillende geslachten te enten. Naast de compatibiliteit van enten en onderstammen is ook de groeikracht van de onderstam en de ent een belangrijke factor die van invloed is op het overleven van enten. Het overlevingspercentage van geënte planten varieert ook per soort, en het overlevingspercentage van het geënte lichaam is zelfs bij dezelfde soort op verschillende leeftijden verschillend. Bovendien kunnen omgevingsfactoren zoals temperatuur, vochtigheid en lichtintensiteit ook van invloed zijn op het overlevingspercentage van geënte planten.

Arabidopsis thaliana en Eutrema salsugineum (Thellungiella salsuginea) behoren tot dezelfde familie Cruciferae, maar tot verschillende geslachten. Arabidopsis thaliana wordt gebruikt als modelplant bij genetische studies van tweezaadlobbigen. Eutrema Salsugineum (ook bekend als zoutkers) is een uitstekende zouttolerante plant, en het genoom van E. salsugineum is voltooid. Ongeveer 95% van de genen in E. salsugineum zijn vergelijkbaar met die welke tot expressie komen in Arabidopsis , en de meeste aminozuursequenties zijn dezelfde als die van Arabidopsis . Eutrema salsugineum heeft een relatief klein nucleair genoom, ongeveer twee keer zo klein als dat van A. thaliana . Alle ecotypes van E. salsugineum vertonen resistentie tegen een reeks milieustresses zoals koude, droogte en oxidatieve stress . E. salsugineum heeft de aandacht getrokken door zijn extreme zouttolerantie. Daarom werd zoutcress meer dan 20 jaar geleden voorgesteld als een modelhalofyt voor het bestuderen van zouttolerantie. Dit heeft een nieuw venster geopend voor onderzoek met betrekking tot een brede waaier van aspecten, waaronder niet alleen abiotische stress , maar ook fotosynthese , stress-gerelateerde eiwitfunctie , en oppervlaktewas productie met behulp van E. salsugineum als een modelplant. In Arabidopsis werden verschillende entbenaderingen ontwikkeld om systemische signalisatie te onderzoeken. Voor zover wij weten is er echter geen verslag over entmethoden voor E. salsugineum, of over entmethoden tussen Arabidopsis en Eutrema. De moeilijkheidsgraad van enten tussen deze planten is aanzienlijk. Succesvolle enting van deze twee modelplanten zal helpen cruciale inzichten te verschaffen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan plantstresstolerantie. Hier demonstreren we twee steriele micro-enting methoden voor inter-generische enten tussen Arabidopsis en Eutrema, met de voordelen van eenvoud en hoge overlevingskans.

Eting methoden

In de huidige studie richten we ons op twee efficiënte steriele zaailing micro-enting protocollen tussen Arabidopsis, een zout-gevoelige plant, en zout cress, een zout-tolerante plant. De ene methode was hypocotyl-hypocotyl vlak-oppervlak snijden van de zaailingen, zoals beschreven door Seung en Turnbull et al. met enkele wijzigingen. De andere methode was het insnijden van enten, wat wij hier zullen demonstreren. De hier gebruikte afkorting A/E betekent dat A. thaliana enten werden geënt op E. salsugineum stammen, en omgekeerd E/A betekent dat E. salsugineum enten werden geënt op A. thaliana stammen. In een controle-experiment werd zelf enting van A. thaliana en E. salsugineum uitgevoerd. De zelfgeënte zaailingen van A. thaliana worden aangeduid als A/A en de zelfgeënte zaailingen van E. salsugineum worden aangeduid als E/E. Geoptimaliseerde entmethoden werden toegepast op verschillende onderstammen en enten. De methode van cut-in enten werd gebruikt voor A/E (Fig. 1a) en de andere methode, d.w.z. hypocotyl-hypocotyl vlak-oppervlak snijden werd gebruikt voor A/A, E/E, en E/A (Fig. 1c, d). Het is betrekkelijk eenvoudig om met de conventionele entmethode (d.w.z. hypocotyl-hypocotyl vlak-oppervlak snijden) succesvol te enten, en de daaropvolgende groei van de geënte planten is meestal bevredigend. Daarom zullen we deze methode hier niet bespreken.

Materialen en groeiomstandigheden

Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col) zaden en E. salsugineum (Shandong, China) zaden die in deze studie zijn gebruikt, zijn bewaard gebleven en vermeerderd in ons laboratorium. De planten werden gekweekt onder lange-dag (LD 16/8 h licht/donker) of korte-dag (SD 8/16 h licht/donker) lichtomstandigheden, met 22 °C/18 °C dag/nacht cycli en 100 μmol m-2s-1 lichtintensiteit.

Enteringsprocedure

Het stapsgewijze protocol van de cut-in enting methode toegepast voor A/E was als volgt:

Voorbereiding van onderstam- en entmateriaal: zoutkerszaden werden ontsmet met 0.5% NaClO (natriumhydrochloriet) gedurende 6 minuten, gevolgd door 4-5 spoelingen in gedestilleerd water, en vervolgens onder steriele omstandigheden gezaaid op Murashige en Skoog (MS) medium van halve sterkte met 1,0% agar en 1% suiker. Een week na de stratificatiebehandeling bij lage temperatuur (4 °C) werden de zaailingen overgebracht naar SD-omstandigheden en gedurende 10-15 dagen (of 7-10 dagen na het ontkiemen) verticaal met licht gekweekt als zaailingen onder de grond. Voor het ontkiemen van Arabidopsiszaden waren de sterilisatiemethode en de groeiomstandigheden dezelfde als die voor E. salsugineum, behalve de stratificatiebehandeling bij lage temperatuur (4 °C), die 2-3 dagen duurde. De optimale leeftijd voor het enten van Arabidopsis zaailingen is 3-5 dagen. Omdat de kiemtijd en de groeisnelheid van de twee soorten verschillend zijn, werden de planttijdstippen dienovereenkomstig aangepast. Gewoonlijk moet Arabidopsis worden geplant na de kieming van de zaden van zoutkers.

1. Enten onder steriele omstandigheden (Fig. 1a): De entprocedure werd uitgevoerd onder anatomische microscopen in een steriele kap. E. salsugineum zaailingen van uniforme grootte werden met behulp van een pincet overgebracht naar nieuw MS-agarmedium van 1,0% halve sterkte. Om als onderstam te worden gebruikt, werden de echte bladeren en meristemen van de zaailingen van zoutkers verwijderd met een roestvrijstalen scheermes met dubbele snede, terwijl de zaadlobben werden behouden. Onder dezelfde steriele omstandigheden werd het hypocotyl van zaailingen van A. thaliana overdwars doorgesneden op ongeveer een vierde van de hoogte vanaf de top (meestal 2-3 mm) en werd het bovenste deel van de zaailing gebruikt als ent. Het snijden van A. thaliana als enten kan rechtstreeks worden uitgevoerd in de oorspronkelijke mediumplaten of in de platen waarop de zoutkers als onderstam is geprepareerd. De A. thaliana scion werd geënt op zoute cress zonder enige bevestiging omdat de minieme hoeveelheid vloeistof aan de snijvlakken van de twee delen voldoende is om ze bij elkaar te houden. Daarna werd de petrischaal snel maar zorgvuldig verzegeld met parafilm om de vochtigheid te bewaren. Let erop dat de bladeren op natuurlijke wijze worden uitgestoken om te voorkomen dat ze door de plantengroei loskomen.

2. Kweek van het geënte lichaam: Het geënte A/E-complex werd onder SD-omstandigheden gedurende 6-8 dagen in een Percival-groeikast geplaatst.

3. Transplantatie van geënte zaailingen (Fig. 2): Zes tot acht dagen na het enten werd de interface van de stuikverbinding onderzocht onder een anatomische microscoop. Tegen die tijd moet de ent een stevige verbinding hebben tussen de ent en de stam. De zaailingen werden vervolgens overgebracht naar een hydrocultuursysteem of voedzame grond naar behoefte. Na het verplanten moet aandacht worden besteed aan het tijdig afsnijden van onbedoelde wortels, als die zich voordoen.

   

   Geënte zaailingen. a Zelf enten van A. thaliana (A/A). b A/E geënte zaailingen. c Zelf enten van E. salsugineum (E/E). d E/A geënte zaailingen. Rode pijlen in a-c geven de entplaatsen aan. Arabidopsis thaliana wortels als onderstam worden getoond door pijlen van verschillende kleuren in d, blauwe pijlen geven de wortels na enting aan, en gele pijlen geven de wortels vóór het enten aan

Ontsmetting van het zaadoppervlak

Bij de methode met ingesneden enten werd het oppervlak van de zaden rechtstreeks ontsmet met 0.5% natriumhydrochloride (NaClO) gedurende 6-8 minuten, en vervolgens 4-6 keer gewassen met steriel water. Bij deze methode wordt het gebruik van alcohol voor sterilisatie vermeden. Bovendien is de sterilisatiemethode met NaClO eenvoudig, waardoor secundaire verontreiniging wordt beperkt, en de zaden normaal kunnen ontkiemen. Ook wordt vermeden dat de zaden niet ontkiemen als gevolg van overmatige sterilisatie, wat de ontkieming van de zaden en de daaropvolgende analyses nadelig beïnvloedt. Zolang de concentratie NaClO goed wordt geregeld, zal er geen oversterilisatie optreden, zelfs niet als de sterilisatie enkele minuten duurt.

leeftijd zaailingen

Bij de cut-in entmethode worden iets oudere E. salsugineum zaailingen (7-10 dagen na ontkieming) met zijwortels, beter aan de snelle groeikenmerken van hun enten (A. thaliana), dit vermindert ook de vorming van onvoorziene wortels, verbetert sterk het overlevingspercentage van enten en verzekert de krachtige groei van geënte zaailingen in het latere stadium (tabel 1). We ontdekten dat 3-5-dagen oude zaailingen van Arabidopsis gunstig waren om het overlevingspercentage van geënte zaailingen te verbeteren; het ondersteunt ook de krachtige groei van geënte zaailingen (tabel 1). Dit kan komen doordat de levenscyclus van A. thaliana kort is, vergeleken met die van E. salsugineum. Daarom resulteerde het gebruik van oudere A. thaliana zaailingen als enten in lage overlevingspercentages; zelfs als de A/E enten overleefden, was de groei in latere stadia gering en wordt meestal vroege bloei waargenomen.

Vlakke-oppervlakte-snijmethode

Er zijn verschillende soorten entmethoden gerapporteerd voor A. thaliana . In de huidige studie werd de methode van cut-in enten alleen gebruikt voor A/E enten en de methode van hypocotyl-hypocotyl vlak-oppervlak snijden werd gebruikt voor A/A, E/E, en E/A (Fig. 1c, d). De twee methoden vereisen dezelfde kweekomstandigheden met uitzondering van de snijplaats. Zaailingen van 3-5 dagen oud werden gebruikt voor A/A zelf-enting. Voor E/A enten zijn 7 tot 10 dagen oude zaailingen van A. thaliana als onderstammen gunstiger voor het overleven van de enten. Op dezelfde manier werden 7-10 dagen oude zaailingen gebruikt voor E/E zelf-enting. We ontdekten dat zowel het overlevingspercentage als de latere groei van A/E zaailingen significant verschilden tussen de twee entmethoden (Fig. 1a, b en Tabel 2). De cut-in methode is bevredigender voor het enten van A/E. De belangrijkste reden hiervoor zou kunnen zijn dat de snelle groeisnelheid van A. thaliana met deze methode beter wordt opgevangen. Bij het traditionele stekken met een plat oppervlak voor A/E enten verschijnen er adventieve wortels van de entstam vóór de eeltvorming bij de kruising, wat van invloed is op het succespercentage van de geënte planten, omdat de groei van tuinkers langzamer is dan die van A. thaliana. Ter vergelijking: het slagingspercentage van de insnijdingsmethode is bijna 100% zolang de insnijding glad is en de twee delen strak tegen elkaar aan liggen.