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Este teste demonstra a capacidade de certas bactérias decomporem o aminoácido triptofano em indole, que se acumula no meio. O teste de produção de Indole é importante para a identificação de Enterobacteria. A maioria das estirpes das espécies E. coli, P. vulgaris, P. rettgeri, M. morgani e Providencia decompõem o aminoácido triptofano com a libertação do indole. Isto é realizado por uma cadeia de várias enzimas intracelulares diferentes, um sistema geralmente referido como “triptofanase”. É utilizado como parte dos procedimentos IMViC,um teste concebido para distinguir entre os membros da família Enterobacteriaceae.

Uma variação neste teste utilizando o reagente de Ehrlich (utilizando álcool etílico em vez de álcool isoamílico, desenvolvido por Paul Ehrlich) é utilizado quando se realiza o teste em não fermentadores e anaeróbios.

Princípio do teste de Indole

Tryptophan é um aminoácido que pode sofrer desaminação e hidrólise por bactérias que exprimem a enzima triptofanase. O indolo é gerado por desaminação redutora do triptofano através da molécula intermédia ácido indolepirúvico. A triptofanase catalisa a reacção de desaminação, durante a qual o grupo amina (-NH2) da molécula de triptofano é removido. Os produtos finais da reacção são o indole, o ácido pirúvico, o amónio (NH4+) e a energia. O fosfato piridoxal é necessário como coenzima.

Quando o indole é combinado com o Reagente de Kovac (que contém ácido clorídrico e p-dimetilaminobenzaldeído em álcool amílico) a solução passa de amarelo para vermelho cereja. Como o álcool amílico não é solúvel em água, a coloração vermelha forma-se numa camada oleosa no topo do caldo.

No teste spot, o indole combina, na matriz de papel filtro, um pH ácido com p-dimetilaminocinamaldeído (DMACA) para produzir um composto azul a azul-esverdeado. O Indole Spot Reagent foi relatado como sendo útil na detecção da produção de indole por membros da família Enterobacteriaceae e certas espécies anaeróbias.

Reagentes utilizados no teste de Indole

Ingredientes por litro:*

Reagente de Indole Spot:

p-Dimetilaminocinamaldeído (DMACA)	10.0 gm
Ácido clorídrico, 37%	100.0 ml
Água Desionizada	900.0 ml

>Álcool amílico

Indole Kovacs Reagent:
p-Dimetilaminobenzaldeído	50.0 gm
Ácido clorídrico, 37%	250.0 ml
750.0 ml

* Ajustado e/ou suplementado conforme necessário para cumprir os critérios de desempenho.

Procedimento do Teste Indolétrico

1. Tomar um tubo de ensaio esterilizado contendo 4 ml de caldo de triptofano.

Inocule o tubo assepticamente levando o crescimento de 18 a 24 horas de cultura.

2. Incubar o tubo a 37°C durante 24-28 horas.

Adicionar 0,5 ml de reagente de Kovac à cultura do caldo.

3. Observar para a presença ou ausência de anel.

Reagente de Indole Spot (DMACA) Procedimento

1. Colocar várias gotas de Reagente de Indole Spot sobre um pedaço de papel de filtro.
2. Com um laço inoculante ou bastão aplicador de madeira, recolher uma porção de uma colónia isolada de 18-24 horas a partir de um meio não selectivo e esfregá-la na área saturada do reagente do papel de filtro.
3. Examinar imediatamente

Resultado Interpretação do Teste Indolétrico

Resultado Interpretação do Teste Indolétrico

Positivo: Formação de uma cor rosa a vermelha (“anel vermelho-cereja”) na camada de reagente no topo do meio em segundos após a adição do reagente.
Exemplos: Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Bacillus alvei,Edwardsiella sp., Escherichia coli, Flavobacterium sp.., Haemophilus influenzae, Klebsiella oxytoca, Proteus sp. (não P. mirabilis e P. penneri), Plesiomonas shigelloides,Pasteurella multocida, Pasteurella pneumotropica, Enterococcus faecalis, e Vibrio sp.

Negativo: Sem mudança de cor mesmo após a adição de reagente apropriado.
Exemplos: Actinobacillus spp., Aeromonas salmonicida, Alcaligenes sp., a maioria Bacillus sp., Bordetella sp., Enterobacter sp., Lactobacillus spp., a maioria Haemophilus sp., a maioria Klebsiella sp., Neisseria sp, Pasteurella hemolítica, Pasteurella ureae, Proteus mirabilis, P. penneri, Pseudomonas sp.,Salmonella sp., Serratia sp., Yersinia sp.

Reagente Indolégiro Resultado

Reacção positiva: O desenvolvimento de uma cor azul em 3 minutos.
Reacção negativa: O desenvolvimento de uma cor rosa dentro de 3 minutos.

Teste Indolo de Ponto

Método

1. Colocar várias gotas de reagente de 1% p-dimetilaminocinamaldeído num pedaço de papel de filtro até à saturação.
2. Com um laço inoculante ou bastão aplicador de madeira, colher uma porção de uma colónia isolada de 18-24 horas de um meio não selectivo e esfregá-la na área saturada de reagente do papel de filtro.
3. Observar para o desenvolvimento da cor dentro de 1 a 3 minutos.

Resultados esperados

• Positivo: Uma reacção positiva é denotada pelo aparecimento de uma mudança de cor azul a azul-verde no esfregaço bacteriano dentro de 2-3 minutos.
• Negativo: As reacções negativas permanecem sem cor ou rosa claro.
  Nota: A reacção positiva é vermelho-violeta no caso de Providencia alcalifaciens.

Uses of Indole Test

1. Para diferenciar Proteus mirabilis (indole negativo) de todas as outras espécies de Proteus (indole positivo).
2. Para diferenciar Klebssiella pneumoniae (indole negativo) de Klebsiella oxytoca (indole positivo).

li> Para diferenciar Citrobacter freundii (indole negativo) de Citrobacter koseri (indole positivo).

Controlo de Qualidade para a Prova de Indolicidade

Controlo Positivo: Escherichia coli NCTC 10418
Controlo Negativo: Proteus mirabilis NCTC 10975

Limitações do Teste de Indolação

1. Testes de Indolação podem ser utilizados como ajuda na identificação e diferenciação de organismos gram-positivos e gram-negativos. Recomenda-se a realização de testes bioquímicos adicionais utilizando culturas puras para uma identificação completa.
2. O teste em tubo é um método mais sensível de detecção do indole do que o teste spot.
3. Ao realizar um teste spot, o Reagente Indol Kovacs pode ser utilizado como um substituto do reagente do teste spot. Contudo, o Reagente Indol Kovacs, quando usado como reagente de teste pontual, é menos sensível na detecção do indole do que o Reagente Indolétrico (DMACA).
4. Kovacs Indole Reagent não é recomendado para uso com bactérias anaeróbias. O Reagente Indole Spot (DMACA) é adequado para utilização com anaeróbios.
5. Peptones demonstraram variar em relação à sua aptidão para utilização com testes de indole, os meios seleccionados para determinação de indole devem ser testados com organismos positivos e negativos conhecidos para assegurar a sua aptidão.
6. Os meios contendo glucose não devem ser utilizados para testes de indole devido à formação de produtos finais ácidos que demonstraram reduzir a produção de indole. Mueller Hinton Agar também não deve ser utilizado para este teste porque o triptofano é destruído durante a hidrólise ácida da caseína.

>Meios contendo corante, tais como MacConkey e EMB, são fontes inadequadas de inóculo devido à possível transferência de corante e subsequente interferência da interpretação da cor indole.

7. Colónias indolo-positivas têm sido relatadas como fazendo com que colónias adjacentes indole-negativas pareçam falso-positivas devido à difusão do indole nos meios de comunicação. Para evitar falso-positivos, seleccionar colónias de morfologias diferentes que são separadas por pelo menos 5mm para testes de indole.